TỔNG QUAN
Sự khởi đầu của việc nuôi cấy vô trùng liên quan chặt chẽ đến sự lựa chọn nguồn mẫu cấy thích hợp và sự chuẩn bị mẫu cấy, bao gồm cả việc tiền xử lý các mẫu (in vivo) nếu cần thiết và các bước khử trùng sau đó. Sự cẩn trọng trong việc lựa chọn mẫu cấy và việc áp dụng một quy trình khử trùng thích hợp có thể thành công trong việc giảm, hoặc loại bỏ sự nhiễm bẩn trong nuôi cấy in vitro đồng thời giảm tác động tiêu cực lên mô tế bào thực vật và sự tái sinh cây con. Nhiều phương pháp nuôi cấy vô trùng độc đáo cho loài Dendrobium đã được báo cáo trong tài liệu này, được mô tả rất chi tiết đối với các mô hoặc kiểu gen cụ thể, và bài viết này không chỉ làm nổi bật các chi tiết của các quy trình mà còn cung cấp những lời khuyên thiết thực cho những người mới vào nghề và thậm chí cả những nhà nghiên nghiên cứu về lan muốn nghiên cứu Dendrobium in vitro, mặc dù nó được cảnh báo rằng hiện nay không có phương pháp nuôi cấy vô trùng phổ quát có thể được áp dụng cho tất cả các điều kiện, tất cả các mẫu cấy hoặc tất cả các kiểu gene.
EX VITRO ĐẾN IN VITRO: SỰ CẦN THIẾT CỦA VIỆC KHỬ TRÙNG BỀ MẶT MÔ THỰC VẬT ĐỂ THIẾT LẬP QUY TRÌNH NUÔI CẤY MÔ DENDROBIUM IN VITRO
Khía cạnh quan trọng nhất trong việc thiết lập một hệ thống nuôi cấy mô hiệu quả từ các mẫu cấy hoặc các bộ phận của cây lấy từ vật liệu ex vitro, như những cây từ nhà kính hoặc từ đồng ruộng, là quá trình khử trùng (George và Debergh 2008). Mặc dù có nhiều khả năng các cây trồng trên đồng ruộng sẽ chứa nhiều chất gây tạp nhiễm từ đất và không khí hơn các cây trồng trong nhà kính (Niedz và Bausher 2002) và các cây trồng trong đất theo kiểu thông thường sẽ bị nhiễm vi sinh vật cao hơn các cây trồng trong môi trường nước, trong mọi trường hợp, vật liệu thực vật cần được chuẩn bị cho nuôi cấy in vitro, thường là trong ba bước sau khi rửa ban đầu và loại bỏ các chất tạp nhiễm thô (Hall 1999): (A) xử lý bằng dung dịch khử trùng (ví dụ: ethanol 70 %), sau đó rửa bằng nước cất vô trùng (SDW) hoặc không; (B) xử lý bằng dung dịch khử trùng khác (ví dụ: sodium hypochlorite (NaOCl)) và (C) cuối cùng rửa bằng SDW ít nhất ba lần. Có sự khác biệt về loại, trình tự và nồng độ các chất khử trùng được sử dụng, sự kết hợp của chúng và thời gian tiếp xúc (Hall 1999, Onwubiko và cộng sự, 2013). Các khía cạnh như độ tuổi của cây lấy mẫu, nhiệt độ, độ ẩm tương đối (RH), thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng, tưới tiêu và bón phân, cũng như loại và kích thước của mẫu cấy, tính bảo lưu cục bộ, kiểu gen, mùa vụ khi thu thập các mẫu cấy, thời gian quá trình khử trùng và nồng độ chất khử trùng sẽ ảnh hưởng đến kết quả của quá trình khử trùng, được giải thích chi tiết hơn trong phần tiếp theo của bài tổng quan này (Traore và cộng sự, 2005., George và Debergh 2008, Dobránszki và Teixeira da Silva 2010, Mihaljevic và cộng sự, 2013). Mục tiêu chính của các bước khử trùng là để tìm ra sự cân bằng giữa giảm lây nhiễm và sự sống sót mẫu cấy và tái sinh, bị ảnh hưởng mạnh bởi trạng thái sinh lý của các mẫu cấy và chất khử trùng được sử dụng vì chúng thường độc đối với tế bào thực vật. Sự phát triển nhanh chóng của các mẫu cấy, hoặc sự úa vàng của mẫu cấy, có thể làm cho các mẫu cấy mô trở nên mỏng đi, dẫn tới chất khử trùng xâm nhập vào sâu trong các mô (Traore và cộng sự, 2005, Jan và cộng sự, 2013). Độ sâu mà chất khử trùng có thể xâm nhập vào mô cũng rất quan trọng và có thể quan trọng hơn đối với các mô như các đầu rễ hoặc củ tiếp xúc trực tiếp với vi sinh vật trong đất nhiều hơn các bộ phận khác như bao phấn có thể được bảo vệ bởi các mô xung quanh khác như các cánh hoa (Sugii 2011). Những hiểu biết về các yếu tố này có thể quyết định sự thành công của sự tăng trưởng, tái sinh hoặc nảy mầm vì điều này chắc chắn sẽ liên quan đến mức độ nhiễm bẩn.
Việc sử dụng những nguyên tắc này, bài tổng quan này nhằm tìm ra quy trình khử trùng đã được sử dụng để chuẩn bị vật liệu thực vật có nguồn gốc in vivo để nuôi cấy in vitro cho Dendrobium vì môi trường in vitro đóng vai trò như một công cụ quan trọng cho nhiều tiến bộ công nghệ sinh học, sự nảy mầm cộng sinh và không cộng sinh và tiến bộ về phân tử, bao gồm chuyển đổi gene (Teixeira da Silva và cộng sự, 2015a, 2015b, 2015c, 2016). Dendrobium là một trong những loài lan lớn nhất, với khoảng 1400 loài (Jin và cộng sự 2009), và có tầm quan trọng về trang trí và làm thuốc (Takamiya và cộng sự, 2011) và do đó phục vụ như là một loài thực vật tối ưu để tiến hành nghiên cứu chủ đề này vì hàng chục nghiên cứu về nuôi cấy Dendrobium in vitro đã được tiến hành. Trong sản xuất thương mại, những quy trình tốt được thiết lập đã được phát triển từ thử nghiệm ban đầu và sai sót (Teixeira da Silva và Winarto 2015, 2016), nhưng đối với các nhà nghiên cứu lan mới làm quen hay nhà nghiên cứu thực vật muốn tìm hiểu để thiết lập quá trình nuôi cấy Dendrobium in vitro ban đầu từ nguồn vật liệu in vivo sẽ không có hướng đi dễ dàng từ nguồn tài liệu rộng lớn để hiểu làm thế nào xử lý tốt nhất vật liệu nuôi cấy để thiết lập một quy trình nuôi cấy in vitro ban đầu. Do đó, bài đánh giá này cũng phục vụ một mục đích rất quan trọng: khảo sát và kiểm tra nguồn tài liệu rộng lớn này để phân tích và xác định các điều kiện đối với các mô từ nhiều nguồn khác nhau và các kiểu gen khác nhau trong việc khử trùng để có thể tái sinh sau này. Ba nghiên cứu liên quan đến quy trình khử trùng cho loài Dendrobium vào năm 2015 và cho đến tháng 3 năm 2016.
LỰA CHỌN CÂY MẸ IN VIVO VÀ MẪU CẤY
Hầu hết các tác giả khi làm việc về nuôi cấy Dendrobium in vitro đều lựa chọn cây mẹ phát triển trong những chậu trong vườn ươm (Malabadi và cộng sự, 2005, Sujjaritthurakarn và Kanchanapoom 2011, Kumari và cộng sự, 2013), nhà kính (Asghar và cộng sự, 2011, Paul và cộng sự, 2012) hoặc nhà lưới (Lone và cộng sự 2008, Dohling và cộng sự, 2012, Vijayakumar và cộng sự, 2012.). Quả và hạt giống cũng được thu thập từ các môi trường tự nhiên hoang dã, như D. huoshanense (Luo và cộng sự 2009) và D. densiflorum (Luo và cộng sự, 2008) hoặc từ các vườn thực vật (Pradhan và cộng sự, 2013) (Tab. 1). Tất cả các môi trường tăng trưởng này không tránh được không bị tạp nhiễm do vi khuẩn, và do đó chúng cần phải được xử lý (khử trùng) trước khi có thể được sử dụng trong môi trường in vitro, do đó kích thích sự phát triển của mô thực vật qua sự phát triển của vi sinh vật.
Nguồn, kích cỡ và độ tuổi của các mẫu cấy là một số yếu tố ảnh hưởng đến thành công của việc khử trùng. Kumari và cộng sự (2013) đã sử dụng các chồi của D. Sonia 'Earsakul', dài 8-12 cm với 3-5 mắt ngủ được lấy từ các chồi 2-3 tuần tuổi ('keikies'), làm mẫu cấy để bắt đầu nuôi cấy vô trùng. Trong nghiên cứu của họ, 66.7 đến 100% các mẫu cấy đã sống sót (2.33 chồi/mẫu cấy với BA 4.0 mg/dm3). Ferreira và cộng sự (2006), đã sử dụng các chồi bên dài 8 cm từ các cây D. 'Second Love' (loại Nobile) trưởng thành, có khoảng 20% mẫu cấy bị tạp nhiễm và chỉ có 60% chồi nụ phát triển thành các chồi. Asghar và cộng sự (Năm 2011), cũng sử dụng các mẫu chồi dài 8 cm để nuôi cấy D. nobile 'Emma White', chỉ có 22.5% mẫu cấy sống sót trong phương pháp xử lý tốt nhất là ngâm và sục liên tục mẫu cấy với 10% NaOCl (chlorine hoạt tính 6-14%) trong 8 phút, tiếp theo là rửa lại 4-5 lần, nhưng mức độ tạp nhiễm cao vẫn được quan sát thấy: nhiễm vi khuẩn 42.5% và nhiễm nấm 30%. Winarto và các cộng sự (2013) đã sử dụng các mẫu chồi đỉnh D. 'Zahra FR 62' dài 0.4 cm làm mẫu cấy để bắt đầu sự hình thành các thể tiền chồi (PLB). PLBs được nuôi cấy thứ cấp sau mỗi 15 ngày, với 85% các mẫu cấy thành công trong việc tạo ra mô sẹo xanh trong phân lớn mẫu cấy; ban đầu, mô sẹo có màu xanh lá đến xanh đậm và nhỏ sau đó trở nên rời rạc trong nuôi cấy thứ cấp tiếp theo và sản sinh ra PLB một cách dễ dàng, và chỉ có 15% mẫu cấy bị tạp nhiễm bởi vi khuẩn và/hoặc bị hóa nâu (Winarto và cộng sự, 2013). Trong nuôi cấy lỏng, có sự trầy xước ở bề mặt của mẫu mô sẹo dẫn tới sự hóa nâu của mô sẹo, gây ra bởi các hợp chất phenol (Kaewubon và cộng sự, 2015) và việc sử dụng các chất khử trừng làm thay đổi màu sắc của các mẫu cấy từ xanh lá đến xanh lá nhạt/trắng, như là một tín hiệu về sự tổn thương mô tế bào (Hình 1F-H). Nguồn mẫu cấy, kích cỡ và biện pháp xử lý giống nhau (xem hình 1C-E), nhưng với độ phản ứng cao hơn (87%) được ghi nhận ở D. 'Gradita 31' (Winarto và Rachmawati 2013). Sự giao thoa giữa lựa chọn mẫu cấy phù hợp, quy trình khử trùng và loại bỏ sự hóa nâu, điển hình cho nuôi cấy mô sẹo Dendrobium còn non (Kaewubon và cộng sự, 2015) sẽ xác định sự thành công của việc kích thích mô sẹo và chồi. Mặc dù các quy trình được mô tả trong Bảng 1 bởi Winarto và cộng sự có hiệu quả đối với một số cây, nhưng không được thử nghiệm cho tất cả các cây.
Nhiều tài liệu (Bảng 1) đã mô tả các điều kiện môi trường trong đó các cây mẹ được trồng, thu thập và chuẩn bị tốt nhất. Lo và cộng sự (2004) chỉ ra rằng loài D. tosaense thu thập được từ môi trường tự nhiên ở Đài Loan được trồng trong chậu có đường kính 13.5 cm và cao 10.7 cm, chứa chất nền là cây dương xỉ; Cây trồng được duy trì trong nhà kính với độ ẩm 70% RH và nhiệt độ ngày/đêm là 25/20°C. Trong điều kiện này, các quả thể 12 tuần tuổi được hình thành sau khi thụ phấn bằng tay tạo ra số cây con cao nhất trong môi trường ½ MS so với các quả thể ở độ tuổi khác (8, 9, 10, 11, 13, 14 tuần tuổi) và ở các môi trường khác (MS, KC, VW). Loài D. nobile thu thập được từ tự nhiên ở Ấn Độ đã được sử dụng làm cây mẹ, được nuôi cấy trong các chậu và trồng trong điều kiện nhà kính. Các chồi đỉnh dài 0.5-0.8 cm được thu hoạch từ các cây mẹ và được sử dụng làm nguồn mẫu cấy (Malabadi và cộng sự, 2005). Các củ bẹ của D. microbulbon thu thập được từ rừng Nam Gujarat (Ấn Độ) đã được sử dụng làm nguồn mẫu cấy chính (Sharma và cộng sự, 2007). Những quả thể trưởng thành của D. densiflorum thu được từ tỉnh Vân Nam, Trung Quốc được sử dụng làm nguồn mẫu cấy (Luo và cộng sự, 2008). Giống D. transparens được thu thập từ môi trường tự nhiên ở Imphal (Ấn Độ) và được giữ ở chỗ mát với ánh sáng mặt trời giảm 50%. Hoa đã được thụ phấn bằng tay vào ngày thứ hai hoa nở vì hoa chỉ kéo dài được 3-5 ngày và quả thể được thu hoạch sau khi thụ phấn 120 ngày và được sử dụng như là các mẫu cấy mẹ cho sự nảy mầm in vitro (Sunitibala và Kishor 2009). Giống D. nanum, thu thập ở vùng KMTR, Nam Ấn Độ, được duy trì trong nhà kính và các chồi 5 cm được sử dụng làm nguồn mẫu cấy (Maridass và cộng sự, 2010). Ở Shillong, Ấn Độ, những cây D. chrysanthum khỏe mạnh được trồng trong các chậu trong nhà kính, và sau khi hoa được thụ phấn bằng tay, và các quả đậu già (8 tháng tuổi) được sử dụng làm mẫu cấy (Hajong và cộng sự, 2010). Các quả đậu D. chrysanthum trưởng thành 3 tháng tuổi và phát triển tốt đã được sử dụng làm mẫu cấy cho những thí nghiệm nảy mầm (Sujjaritthurakarn và Kanchanapoom 2011). Những quả thể già (15 tháng) của D. aphyllum được thu thập từ môi trường sống hoang dã ở Sarisha, Ấn Độ (Dutta và cộng sự, 2011). D. chrysanthum, D. hookerianum và D. longicornu đã được thu thập từ Meghalaya, Ấn Độ, được trồng trong nhà kính và các mẫu cấy thân (dài 1-2 cm), mỗi cây bao gồm một mắt và chồi nách, được sử dụng làm các mẫu cấy (Dohling và cộng sự. 2012). Paul và cộng sự (2012) đã sử dụng những quả thể màu xanh tía của D. hookerianum thu hoạch được sau 8-9 tháng kể từ thụ phấn. Vijayakumar và cộng sự (2012) đã sử dụng việc thụ phấn tay vào ngày thứ hai sau khi nở hoa để thu được những quả từ cây D.posgattum mà được thu thập từ môi trường tự nhiên sau đó trồng chúng dưới bóng mát (75% bóng mát). Chồi dài 8-12 cm với 3-5 mắt đã được thu hoạch từ các cây non 2-3 tuần tuổi của các cây mẹ trồng trong nhà kính được sử dụng làm mẫu cấy phù hợp (Kumari và cộng sự, 2013).
Đối với D. 'Zahra FR 62' và D. 'Gradita 31', các cây mẹ được duy trì dưới bóng mát trong nhà kính (75%) trong hỗn hợp thân khô cây thiên tuế (Cycas rumphii) và than củi (1:1, v/v) bằng cách tưới nước mỗi sáng lúc 7:00-8:00 và bón phân 2g/dm3 N:P:K tỷ lệ 20:20:20 và dùng 2 ml/dm3 phân bón lỏng BioSugih hai lần một tuần để kích thích sinh trưởng của cây mẹ và tăng tốc độ phát triển của củ bẹ mới.
Xem bài viết gốc: https://www.sbc-vietnam.com/san-pham/hoa-chat-dung-cu-nuoi-cay-mo-thuc-vat/nuoi-cay-mo-lan-invitro-dendrobium-khu-trung-mo-d.aspxMinh Hiếu
Khử trùng inviro cho Lan
4/
5
Oleh
Nuôi Cấy Mô Thực Vật
