Thứ Ba, 29 tháng 5, 2018

Tái sinh in vitro cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) sử dụng tỷ lệ nồng độ hormone khác nhau


Tóm tắt


Một trong những mục tiêu của thí nghiệm là chuẩn hóa nồng độ HgCl2 để xử lý mẫu trong quá trình khử trùng. Các mục tiêu khác bao gồm phát triển một quy trình tái sinh hiệu quả về chi phí để sản xuất quy mô lớn cây con Solanum tuberosum thuộc giống Cardinal từ các dòng vô tính có chọn lọc tốt hơn thông qua phương pháp nhân giống in vitro. Lựa chọn chất điều hòa tăng trưởng cho việc tái sinh, kéo dài nhiều chồi cây và cảm ứng ra rễ. Để sản xuất cây con đồng nhất về mặt di truyền trong một thời gian ngắn và có khả năng sống sót trong điều kiện tự nhiên sau khi được nuôi cấy trong môi trường in vitro. Các mẫu đỉnh chồi cây và đoạn mắt từ cây khoai tây trên đồng ruộng được sử dụng làm vật liệu thí nghiệm trong nghiên cứu này. Tất cả các cây trồng được nuôi cấy trên môi trường Murashige và Skoog có bổ sung các chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác nhau. Để khử trùng bề mặt mẫu, xử lý với HgCl2 (0.1%) trong 2 phút cho hiệu quả nhất trong việc phá hủy hoàn toàn các mầm bệnh ở bề mặt mẫu và thu được các mô khỏe mạnh. Việc tái sinh chồi cây được quan sát trên cả hai loại mẫu là đỉnh chồi cây và các đoạn mắt. Môi trường Murashige và Skoog không chứa hormone có số lượng chồi cây tối đa (17) trên mỗi mẫu nuôi cấy và cũng thu được chiều dài trung bình của chồi cây cao nhất (5cm). Mặt khác, trong 3 môi trường với 6-benzyl amino purine, nồng độ 0.2mg/L cho thấy tỷ lệ nhân chồi cây cao nhất (73%) và chiều dài trung bình cao nhất (4cm). Với Gibberellic acid thì nồng độ 0.1mg/L trong môi trường Murashige và Skoog cho thấy tỷ lệ tái sinh chồi cây cao nhất (82%) và chiều dài trung bình cao nhất (4.5cm). Qua toàn bộ thí nghiệm đã cho thấy rằng các đỉnh chồi cây có đáp ứng tốt cho quá trình vi nhân giống. Trong cảm ứng tạo rễ, môi trường Murashige và Skoog được bổ sung với nồng độ khác nhau (0.5, 1, 1.5 và 2mg/L) indol-3-acetic acid và kinetin. Trong đó, với nồng độ 1.5 mg/L indol-3-acetic acid +1.5mg/L kinetin cho thấy tỷ lệ tái sinh rễ thấp nhất (40%) và chiều dài trung bình của rễ chỉ đạt 1.5 cm. Ngược lại, môi trường Murashige và Skoog không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng cho thấy tỷ lệ tái sinh rễ đạt 96% và chiều dài trung bình của rễ cao nhất (2.5 cm). Môi trường Murashige và Skoog không bổ sung hormone cho thấy hiệu quả tái sinh rễ tốt nhất.

Từ khóa: Tái sinh; khoai tây, indole acetic acid (IAA); kinetin (KIN)

1. Giới thiệu


Khoai tây (Solanum tuberosum L.) là một loài tứ bội mang củ thuộc họ Solanaceae. Khoai tây được nuôi cấy có 4 bộ nhiễm sắc thể, tuy nhiên có khoảng 150 loài “khoai tây” hoặc Solanum mang củ là loài tứ bội, tam bội, nhị bội,… Khoai tây thuộc họ gồm khoảng 90 chi và 2500 loài. Mặc dù họ này có thể được tìm thấy trên toàn thế giới, nhưng tập trung nhiều ở những vùng nhiệt đới của châu Mỹ Latin (Cearley và Bolyard, 1997). Khoai tây không chỉ là một loại cây rau màu quan trọng mà còn là một cây lương thực thay thế lúa gạo và lúa mì tại Bangladesh. Củ khoai tây là một dạng thân bị biến đổi. Thành phần của nó gồm khoảng 70-75% nước, 25-30% vật chất khô; hàm lượng tinh bột cao (nhiều hoặc ít hơn 20%); ít đường (<3%), có 5-8% protein trên trọng lượng khô.

Khoai tây sản xuất gần gấp đôi lượng calories mỗi hectare so với gạo hoặc lúa mì (Trujillo et. al., 2001). Khoai tây cũng sản xuất protein hiệu quả hơn 83% so với lúa gạo. Củ khoai tây là một trong những nguồn giàu vitamin nhóm B-complex nhất, như pyridoxine (vitamin B6) thiamin, niacin, pantothenic acid và các folate. Củ khoai tây tươi cũng là một nguồn dồi dào vitamin-C, một tác nhân chống oxi hóa.

Mục tiêu của thí nghiệm bao gốm chuẩn hóa việc xử lý mẫu với HgCl2 trong quá trình khử trùng mẫu. Để phát triển một quy trình tái sinh hiệu quả về chi phí nhằm sản xuất quy mô lớn cây con Solanum tuberosumi giống Cardinal từ các dòng vô tính có chọn lọc tốt hơn thông qua phương pháp nhân giống in vitro. Chọn chất điều hòa tăng trưởng cho mục đích tái sinh, kéo dài nhiều chồi cây và cảm ứng tạo rễ. Sản xuất cây con đồng nhất về mặt di truyền. Thu được số lượng lớn cây con trong một thời gian ngắn. Để thiết lập cây con in vitro phát triển trong môi trường tự nhiên.

2. Vật liệu và phương pháp


Thí nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Kỹ thuật Di truyền và Công nghệ Sinh học, Đại học Khoa học và Công nghệ Jessore, Bangladesh.

Các đỉnh chồi và đoạn mắt được sử dụng cho vi nhân giống cây Solanum tuberosum (potato), một giống Cardinal. Mẫu đã khử trùng bề mặt được cắt thành những đoạn dài 1.0-1.5cm. HgCl2 (0.1%) được sử dụng như một tác nhân khử trùng bề mặt trong thời gian khác nhau, từ 1 đến 5 phút, sau đó rửa kỹ dưới vòi nước máy đang chảy và xử lý tiếp với hai giọt Tween-20 (tác nhân thấm ướt) trong 5-6 phút rồi rửa lại nhiều lần các mẫu vật liệu bằng nước cất. Tiếp theo, sử dụng savlon (ACI Ltd. BD) như chất tẩy rửa và tác nhân hoạt động bề mặt. Để nuôi cấy cây, các loại muối khoáng cơ bản đã được sử dụng bao gồm các loại đa khoáng, vi khoáng và vitamin. Trong thí nghiệm hiện tại, môi trường nuôi cấy khác nhau với nhiều loại chất điều hòa tăng trưởng và phụ gia khác nhau được sử dụng để nuôi cấy đỉnh chồi và đoạn mắt: (a) Môi trường Murashige và Skoog (MS - Murashige và Skoog, 1962) với nồng độ khác nhau của 6-benzyl amino purine, Gibberellic acid được sử dụng riêng lẻ để cảm ứng tạo chồi cây. Về nguồn carbon, 3% đường được sử dụng và môi trường được tạo thạch bằng 6-6.2% agar (b) Môi trường MS và ½MS với nồng độ indol-3-acetic acid và kinetin khác nhau được sử dụng để cảm ứng ra rễ.

pH của môi trường được chỉnh đạt 5.8 bằng cách sử dụng NaOH 1N. Hấp khử trùng môi trường ở 121OC trong 20 phút sau khi chỉnh pH. Các mẫu được cấy vào môi trường cảm ứng tạo sẹo ở 25 ± 20C trong 3-6 tuần trong điều kiện ánh sáng trắng (2500-3000 lux). Chu kỳ quang được duy trì chung là 16 giờ sáng và 8 giờ tối. Các vật chứa dùng để nuôi cấy như ống nghiệm, bình tam giác (erlen thủy tinh), các dụng cụ và thiết bị khác như ống đong, đũa thủy tinh, cốc becher, dụng cụ bơm pipette, parafilm, nút bông, dây thun, giấy lọc, giấy bạc (giấy nhôm), kẹp, hộp quẹt, bút marker, đèn cồn, kim, lưỡi dao sắc, kính hiển vi soi nổi, cân điện tử, nồi hấp, máy đo pH, máy khuấy từ, tủ cấy vô trùng (laminar airflow machine),… được sử dụng cho nghiên cứu này. Dữ liệu được ghi nhận với các thông số sau: thời gian khác nhau để khử trùng bề mặt mẫu, số ngày để chồi cây tái sinh, số lượng chồi cây mỗi mẫu, số ngày cảm ứng ra rễ, số lượng rễ từ mỗi mẫu cấy.

3. Kết quả


Nghiên cứu này đề cập đến ảnh hưởng của nồng độ HgCl2 khác nhau trong thời gian xử lý khác nhau khi khử trùng bề mặt mẫu, vi nhân giống và đưa cây con in vitro ra môi trường tự nhiên. Một số thí nghiệm được xây dựng với những loại mẫu khác nhau như: các đoạn mắt, các đỉnh chồi cây. Các mẫu này được sử dụng để cảm ứng tạo chồi cây và ra rễ đối với những chồi cây đã tái sinh in vitro.
Việc chuẩn hoá quá trình khử trùng bề mặt mẫu được thực hiện bằng các thử nghiệm và thí nghiệm sai số. Khử trùng bề mặt mẫu được thực hiện với dung dịch HgCl2 0.1% trong khoảng thời gian khác nhau từ 1 đến 5 phút. Ảnh hưởng của thời gian xử lý đến sự khử trùng bề mặt mẫu được tổng hợp trong Bảng 1.
Khi xử lý với dung dịch HgCl2 0.1% trong 1 phút, mẫu không thể được khử nhiễm khi nuôi cấy trên môi trường Murashige và Skoog. Khi xử lý trong 1.5 phút, 80% mẫu được khử nhiễm và 90% các đoạn mắt với mô khoẻ mạnh được ghi nhận khi xử lý trong 2 phút. Mẫu không nhiễm nhưng một phần hoặc toàn bộ mô bị chết khi xử lý mẫu trong một thời gian dài (5 phút).
Với nồng độ HgCl2 thấp hơn và xử lý trong thời gian ngắn không thể giết chết vi sinh vật trên bề mặt mẫu, tất cả mẫu nuôi cấy bị nhiễm sau 4-6 ngày nuôi cấy. Khi sử dụng nồng độ HgCl2 cao hơn trong thời gian ngắn cho thấy một số hiệu quả nhưng nếu xử lý trong thời gian dài thì sẽ gây chết mô cấy.
Khử trùng bề mặt mẫu được chuẩn hoá với dung dịch HgCl2 trong 2 phút cho hiệu quả tốt nhất.

Bảng 1: Ảnh hưởng của thơi gian xử lý khác nhau với HgCl2 khi khử trùng bề mặt mẫu

Ghi chú: - = Không nhiễm; *= Mô chết một phần; **=Mô chết vừa phải; ***= Mô chết hoàn toàn

Các chất điều hòa tăng trưởng khác nhau bao gồm 6-benzyl amino purine và gibberellic acid được sử dụng ở nồng độ khác nhau để kích thích tạo chồi trực tiếp từ các mẫu mắt và đỉnh chồi cây khoai tây (Hình 1). Các đoạn mắt và chồi cây được trải qua quá trình phát sinh cơ quan trực tiếp trên môi trường Murashige và Skoog có bổ sung các chất điều hoà tăng trưởng với nồng độ và sự kết hợp khác nhau. Tái sinh in vitro mẫu đốt cây cũng đã được ghi nhận (Hình 2). Khi thử nghiệm với 6-benzyl amino purine, bốn nồng độ khác nhau (0.1, 0.2 và 0.3) được sử dụng để kiểm tra tác động của chúng đến sự kích thích tạo nhiều chồi cây từ các đỉnh chồi và các đoạn mắt. Kết quả của nghiên cứu này đã được trình bày trong Bảng 2. Tỷ lệ nhân chồi cao nhất (73%) được nhận thấy trên môi trường Murinige và Skoog + 0.2mg/L 6-benzyl amino purine, thu được tối đa 12 chồi cây trên mẫu cấy trong 10-15 ngày. Chồi cây dài nhất được ghi nhận là 4cm. 

Tỷ lệ nhân chồi cây thấp nhất là 56% và chiều dài của chồi thu được là 3cm trong môi trường Murashige và Skoog + 0.1mg/L 6-benzyl amino purine sau 15-20 ngày.

Bảng 2: Ảnh hưởng của nồng độ cytokinetinin (6-benzyl amino purine) đến sự tái sinh nhiều chồi cây từ các đỉnh chồi và đoạn mắt.

Các nồng độ gibberellic acid khác nhau (0.1, 0.2 và 0.3mg/L) được thử nghiệm để xác định tác động của chúng đến việc nhân nhiều chồi cây từ các đỉnh chồi và các đoạn mắt. Kết quả được trình bày trong Bảng 3. Phần trăm đáp ứng nhân chồi cây cao nhất (82%) được ghi nhận trong môi trường Murashige và Skoog + 0.1 mg/L gibberellic acid. Ở nồng độ này, thu được số lượng chồi cây tối đa từ mẫu là 15 chồi sau 9-12 ngày nuôi cấy. Chồi cây dài nhất được ghi nhận là 4.5 cm.

Việc cảm ứng tạo chồi cây giảm dần được quan sát thấy khi nồng độ gibberellic acid tăng lên trên 0.1mg/L. Tỷ lệ nhân chồi thấp nhất là 63% và chiều dài chồi là 3cm thu được sau 10-15 ngày khi sử dụng môi trường Murashige và Skoog bổ sung gibberellic acid ở nồng độ 0.3mg/L.

Môi trường Murashige và Skoog không bổ sung hormone cũng được sử dụng để thử nghiệm tác động đến quá trình cảm ứng nhân chồi từ các đỉnh chồi và đoạn mắt. Kết quả cũng được thể hiện trong Bảng 3. Mười mẫu được cấy vào môi trường Murashige và Skoog không hormone, sau 7-10 ngày có 95% mẫu đáp ứng và số lượng chồi cây mỗi mẫu cấy là 17. Chồi cao nhất đạt 5cm. Dữ liệu phân tích đã cho thấy tỷ lệ tái sinh chồi cây trong môi trường Murashige và Skoog không có chất điều hòa tăng trưởng cao hơn so với môi trường có bổ sung 6-benzyl amino purine và gibberellic acid. Việc nhân chồi cây và rễ trong môi trường không bổ sung hormone cũng cho hiệu quả tốt nhất (Hình 3)

Bảng 3. Ảnh hưởng của nồng độ gibberellic acid khác nhau đối với sự tái sinh nhiều chồi từ các đỉnh chồi và đoạn mắt

M = Trung Bình; S.E. = Sai số chuẩn


Hình 1. Mẫu cây khoai tây được cấy (Đỉnh chồi).  Hình 2. Tái sinh cây in vitro từ đoạn đốt cây

Các vi chồi được cấy vào môi trường MS và ½ MS (MS: Murashige và Skoog) được bổ sung các chất điều hòa tăng trưởng. Trong thử nghiệm này, indol-3-acetic acid và kinetin được sử dụng kết hợp, các chồi cây được cắt từ mẫu nuôi cấy in vitro và cấy chuyền vào cả hai môi trường MS và ½MS có bổ sung indol-3-acetic acid và kinetin với các nồng độ khác nhau (0.5, 1, 1.5 và 2mg/L). Trong cảm ứng tạo rễ cho các chồi cây đã tái sinh in vitro, môi trường ½MS hình thành nên các rễ dài hơn nhiều so với môi trường MS. Tuy nhiên, trong môi trường MS, hầu hết các mẫu đều tạo được bộ rễ khỏe mạnh với một ít mô sẹo hình thành ở phần gốc. Tỷ lệ phần trăm cảm ứng tạo rễ thấp nhất là 40% được ghi nhận trong môi trường Murashige và Skoog bổ sung 1.5mg/L (indol-3-acetic acid + kinetin) với số lượng rễ trung bình (4.25) và chiều dài rễ trung bình (1.5cm) quan sát được cũng là thấp nhất. Tỷ lệ ra rễ cao nhất (96%) được tìm thấy trong môi trường MS0 với số rễ trung bình là 6.25 và chiều dài rễ trung bình là 2.5cm. Nồng độ hormone cao hơn cho thấy những tác động tiêu cực đến việc cảm ứng ra rễ.

Các cây được nhân giống in vitro chưa sẵn sàng để chuyền vào trồng trong môi trường đất tự nhiên. Giai đoạn thích nghi thường được sử dụng, trong đó cây được chuyển từ điều kiện in vitro sang điều kiện ẩm của nhà kính và độ ẩm được giảm dần trong 3-4 tuần sau đó để giống với môi trường đất trồng tự nhiên. Trong nghiên cứu hiện tại, các nỗ lực khác nhau đã được thực hiện để thiết lập cây con và đã thu được tỷ lệ cây con sống rất cao (85%) trong điều kiện môi trường đất. Khi các cây con tái sinh hình thành được bộ rễ phát triển tốt trong môi trường Murashige và Skoog, chúng được chuyển vào đất. Trước khi chuyển, những cây con riêng lẻ đã ra rễ đầy đủ được đưa ra khỏi ống nghiệm và bộ rễ của chúng được làm sạch agar dưới dòng nước cất vô trùng chảy liên tục, việc này được thực hiện một cách cẩn thận để không làm hỏng bộ rễ. Cây con sau đó đã sẵn sàng để chuyển. Các cây con đã ra rễ in vitro được trồng ban đầu trong các khay nhựa đặc biệt và sau đó chuyển vào trong các chậu nhỏ chứa đất vườn, phân ủ và cát với tỷ lệ 2:2:1 hoặc hỗn hợp cát, đất và phân chuồng vô trùng (tỷ lệ 1:1:1). Mỗi chậu được bao kín bằng một túi polythene sau khi tưới nước và đặt trong tủ tăng trường thực vật. Các túi này được mở dần hàng tuần. Sau ba tuần thích nghi với điều kiện trong nhà, cây con đã được chuyển sang các chậu lớn để tăng trưởng hơn nữa. Sau đó, chúng tiếp tục được chuyển ra trồng trên các đồng ruộng. Không có sự biến đổi hình thái nào được nhận thấy trên những cây này khi so sánh với những cây có nguồn gốc từ đồng ruộng.

Bảng 4. Ảnh hưởng của các nồng độ auxin khác nhau (indol-3-acetic acid và α-napthalene acetic acid) trong môi trường Murashige và Skoog trong việc cảm ứng ra rễ từ các chồi cây tái sinh.


Hình 3. Nhân nhiều chồi cây và rễ từ mẫu cấy

4. Thảo luận


Nghiên cứu này đã được tiến hành nhằm xây dựng một quy trình tái sản xuất để nhân giống nhanh cây khoai tây. Kĩ thuật in vitro cung cấp một phương pháp thay thế khả thi cho việc sản xuất hàng loạt cây khỏe mạnh với đặc tính đồng nhất (Lim và Kong, 1985). Kỹ thuật này đang dần trở nên phổ biến như một giải pháp thay thế để nhân giống vô tính các cây trồng thương mại quan trọng. Với sự trợ giúp của nuôi cấy mô, có thể nhân giống một số lượng lớn các cây con từ những mẫu đơn trong khoảng thời gian ngắn hơn (Bajaj và cộng sự, 1981). Đã có nhiều báo cáo về việc sử dụng HgCl2 để khử trùng bề mặt mẫu có nguồn gốc từ các cây trồng trên đồng ruộng (Boxus, 1974). Trong một công trình nghiên cứu khác, Druart và Gruselle (1986) đã mô tả rằng nồng độ chất khử trùng và thời gian khử trùng được điều chỉnh phụ thuộc vào độ nhạy của mẫu đối với tác nhân đó.

Trong nghiên cứu này, các nguyên liệu thực vật từ cây trồng ngoài đồng ruộng được sử dụng để thiết lập mẫu nuôi cấy ban đầu. Các thảo luận dưới đây nhằm nỗ lực để chứng minh cho các kết quả thu được trong cuộc điều tra hiện tại.

Đối với các thí nghiệm in vitro, khử trùng bề mặt là việc cần thiết để làm sạch vi sinh vật khỏi mẫu cấy. Để khử trùng bề mặt mẫu, các nhà nghiên cứu đã sử dụng nhiều loại tác nhân khử trùng với nồng độ khác nhau. Việc xử lý có thể bao gồm dung dịch sodium hypochloride 1%, alcohol 70%, dung dịch HgCl2 0.1%, dung dịch bạc nitrate 1% (Hoque, 2010). Ngoài ra còn có nhiều báo cáo khác về việc sử dụng HgCl2 (Bhowani và Razdan, 1983) để khử trùng bề mặt mẫu. HgCl2 (0.1%) được sử dụng trong ba phút cho các loại cây trồng khác nhau (Shirin và cộng sự., 2007).

Kết quả quan sát cho thấy rằng khoảng 90% mẫu sạch nhiễm và mô không bị tổn thương khi được xử lý bằng dung dịch HgCl2 0.1% trong 2 phút, kết quả này được xem là hiệu quả nhất và phù hợp để tiến hành nhân chồi cây.

Trong nghiên cứu gần đây, đỉnh chồi và đoạn mắt của mẫu được lấy từ các phần non, mới hình thành của cây để thực hiện nhân chồi. Các mẫu này đáp ứng rất cao trong môi trường Murashige và Skoog không bổ sung hormone. Khi sử dụng 6-benzyl amino purine, tỷ lệ phần trăm mẫu nuôi cấy đáp ứng cao nhất (73) được ghi nhận trong môi trường có chứa nồng độ 0.2 mg/L và số lượng chồi cây tối đa chồi trên mẫu nuôi cấy là 15 trong 9-12 ngày.

Sự phát triển chồi cây cũng như việc ra rễ của các chồi cây đã tái sinh thì đặc biệt quan trọng cho quá trình thiết lập các chồi cây có nguồn gốc nuôi cấy mô. Mặc dù trong hầu hết các trường hợp, các chồi cây đã tái sinh tạo rễ một cách tự nhiên. Phần trăm ra rễ cao nhất là 96% ghi nhận được trong môi trường Murashige và Skoog với số rễ trung bình là 10.45 và chiều dài rễ trung bình là 2.5cm. Tỷ lệ thấp nhất (40%) được tìm thấy trong môi trường Murashige và Skoog có bổ sung 1.5mg/L indol-3-acetic acid + kinetin với số rễ trung bình là 4.25 và chiều dài rễ trung bình là 1.5cm. Sự phát sinh rễ trong môi trường tạo chồi cây không phổ biến và sự phát sinh chồi cây lại thường diễn ra trên môi trường tái sinh (Struik và Wiersema, 1999). Các chồi cây này đã ra rễ trên môi trường ¼ Murashige và Skoog có bổ sung indol-3-butaric acid hoặc α-napthalene acetic acid. Việc sử dụng nồng độ muối Murashige và Skoog thấp trong môi trường để tạo rễ in vitro cho các chồi cây là một kinh nghiệm rất phổ biến (Hossain và Hồi giáo, 2013).

Với kết quả trên có thể kết luận được rằng, đối với cây khoai tây, ngay cả những mẫu vật liệu có thích thước nhỏ vẫn có khả năng tạo ra số lượng lớn các cây con trong một khoảng thời gian ngắn. Phương pháp này cũng đáng tin cậy và kinh tế để duy trì các cây trồng sạch mầm bệnh trong giai đoạn có thể cho phép nhân giống nhanh, tạo thuận lợi cho việc trao đổi nguồn giống (germplasm) và vận chuyển chúng, cũng có thể sử dụng cho mục đích thương mại trong công nghiệp dược phẩm đặc biệt trong những giai đoạn trái mùa.

5. Kết luận


Kết quả của nghiên cứu đã chuẩn hóa nồng độ HgCl2 cho việc khử trùng mẫu Solanum tuberosum. Quan trọng hơn, nghiên cứu này cũng cung cấp một kết quả phù hợp trong việc lựa chọn các chất điều hòa tăng trưởng để tái sinh nhiều chồi cây, kéo dài chồi và cảm ứng tạo rễ nhằm mục đích sản xuất cây con đồng nhất về mặt di truyền. Kỹ thuật này đang trở nên phổ biến như một giải pháp thay thế cho nhân giống thực vật vô tính những cây trồng thương mại quan trọng như khoai tây. Kỹ thuật nhân giống in vitro có một số ưu điểm so với phương pháp thông thường và có thể được sử dụng rộng rãi cho vi nhân giống thương mại.

Xung đột lợi ích


Không có tuyên bố xung đột

Lời cám ơn 


Tác giả rất biết ơn Bộ môn Kỹ thuật di truyền và Công nghệ Sinh học, Đại học Khoa học và Công nghệ Jessore.

Tài liệu tham khảo


Bajaj YPS, 1981. Regeneration of plants from potato meristems freeze preserved for 24 months. Euphytica, 30(1): 141-145.
Bhojwani SS, 1990. Plant tissue culture: Applications and limitations. Elsevier Sci. Publ. AMurashige and Skoog terdam, the Netherlands. pp. 461.
Boxus P, 1974. The production of strawberry plants by in vitro micro propagation. J. Hort. Sci. 49:209-210.
Cearley JA and MG Bolyard, 1997. Regeneration of Solanum tuberosum cv. Katahdin from leaf explants in vitro. Am. Potato J., 74: 125-129.
Druat P and R Grusella, 1986. In: Y.P.S. Bajaj (ed.). Biotechnology in agriculture and foresty, Vol. I. Springer; Berlin. Fruit trees, I: plum (Prunus domestica). pp. 130-154.
Hossain MM and MR Islam, 2013. Seed potato production technology for small-scale low input framers in Bangladesh. In: Peter K.V. and P. Hazra (eds). Handbook of Vegetables. Stadium Press, Houston, Taxas, USA.
Hoque ME, 2010. In vitro regeneration potentiality of Potato under Different Hormonal Combination
Department of Biotechnology. Agril. Sci., 6 (6): 660-663.
Lim-Ho CL and LS Kong, 1985. Micropropagation of lagerstroemia speciosa (L) pers. (Lythraceae). Garden bulletin, Botanic Garden, Singapore. 38(2):175-184. 
Murashige T and F Skoog, 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue
cultures. Physiologia Plantarum, 15: 473-497.
Shirin F, M Hossain, MF Kabir, M Roy and SR Sarker, 2007. Callus induction and plant regeneration from internodal and leaf explants of four potato cultivar. World J. Agril. Sci., 3(1): 01-06.
Struik PC and SG Wiersema. 1999. Seed potato technology. Wageningen Pers, Wageningen. The Netherlands. 
Trujillo C, ER Arengo, S Jaramillo, R Hoyos, S Orduz and R Arango, 2001. One step transformation of two andean potato cultivars (Solanum tuberosumL. subsp. Andigena). Pl. Cell Rep., 20: 639-641.

Nguồn www.ebupress.com

Thứ Sáu, 25 tháng 5, 2018

Các phương pháp vô trùng trong phòng thí nghiệm


Việc vô trùng các vật dụng, môi trường nuôi cấy là rất quan trọng trong phòng thí nghiệm. Chúng quyết định thành công của quá trình nghiên cứu, sản xuất. Mục tiêu của việc vô trùng là loại bỏ, phá hủy  các loại vi trùng, vi sinh vật, kể cả nha bào. Các phương pháp vô trùng gồm có phương pháp khử khuẩn bằng nhiệt khô (sấy khô), hấp tiệt trùng, và khử khuẩn bằng hóa học.

Phương pháp sấy khô

Phương pháp sấy khô dùng để tiệt trùng các vật dụng không cháy được như kim loại, thủy tinh ví dụ như bình tam giác, ống nghiệm, que cấy, pence kẹp... Thời gian là 170oC trong 2 giờ hoặc 180oC trong 1 giờ tất cả vi khuẩn và nha bào đều bị diệt. Vật dụng sấy khô vô trùng có thể dùng trong 7 ngày, nếu để quá thời gian phải sấy lại.

Phương pháp khử trùng bằng hóa chất

Phương pháp này dùng các loại hóa chất để diệt khuẩn như cồn, muối thủy ngân, javel, formaldehyde... Đa phần hóa chất tiệt trùng nên hạn chế tiếp xúc trực tiếp. Cần phải có biên pháp bảo hộ khi thao tác với hóa chất.



Phương pháp hấp tiệt trùng( hấp ướt)

Phương pháp hấp tiệt trùng ướt thường dùng nồi hấp tiệt trùng ( autoclave) để tiêu diệt các loại vi khuẩn, vi sinh vật. Phương pháp hấp tiệt trùng sử dụng hơi nước để tiệt trùng, nhiệt độ yêu cầu khi hấp thường là 121oC. Trong nồi hấp rất kín nên có thể dùng áp suất để đưa lên đúng nhiệt độ 121oC. Thương thường thời gian hấp môi trường là 15 phút, đối hấp các dụng cụ có thể tăng thời gian lên gấp đôi, trong 30 phút.

Tùy vào tình trạng nhiều hay ít không khí, hơi nước sẽ có nhiệt độ 100, 110, 115, 121oC... Vì vậy nồi hấp sẽ có 1 van cơ khí để loại không khí ẩm( khí lạnh) ra ngoài, dân thợ gọi là bẫy hơi. Van này có dạng lồng đèn xếp, bình thường van này hở cho không khí từ buồng thoát ra ngoài. Nhiệt độ tăng, kim loại của van nở ra, khép dần lại, đến 121 độ đóng kín hoàn toàn. (Các nồi hấp tự động sử dụng vi điều khiển sẽ không có van này, thay vào đó là van điện từ, một chương trình nhỏ sẽ mở van này loại không khí ẩm ra ngoài và đóng lại).

Van này sử dụng lâu ngày, cặn bẩn đóng kín, làm cho nồi hấp không loại khí ẩm( khi lạnh) ra ngoài được. Áp suất lên 2bar, nhiệt độ không đạt 121 độ, nếu tiếp tục hoạt động sẽ hết nước gây nổ điện trở, hỏng máy mà không thấy tình trạng quá nhiệt hơi nước. Do đó, cần tháo van và vệ sinh để khắc phục vấn đề.

Nồi hấp( autoclave) thường có 3 loại như sau: Nồi hấp thủ công, nồi hấp bán tự động và tự động. Nối hấp thủ công thì phải vận hành các giai đoạn bằng tay, canh chỉnh sao cho đúng quy trình. Nồi hấp bán tự động chỉ cần cài đặt thời gian tiệt trùng, khi nồi báo kết thúc thì mở van xả. Còn nồi hấp tự động thì chỉ cần bỏ dụng cụ, môi trường vào, cài đặt chế độ và để chúng tự vận hành.

SBC Scientific

Thứ Hai, 21 tháng 5, 2018

NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN DENDROBIUM OFFICINALE KIMURA ET MIGO THẠCH HỘC THIẾT BÌ



TÓM TẮT 


Lan Dendrobium officinale Kimura et Migo. (Thạch hộc Thiết bì) là giống lan quý được sử dụng làm thuốc và thực phẩm chức năng chữa bệnh tiểu đường và các bệnh nan y đang được thương mại hóa rộng rãi trên thế giới. Kết quả nghiên cứu đã chỉ rõ: Nhân giống bằng gieo hạt trên môi trường VW+ 10g sucrose + 6g agar + 100ml nước dừa (ND)/lít môi trường, nhân nhanh cụm chồi tốt nhất trên môi trường MS + 100ml ND + 20g sucrose + 6g agar + 60g chuối chín/lít môi trường. Nhân giống vô tính thông qua nuôi cấy đoạn thân mang mắt ngủ sử dụng đoạn thân in vitro mang 2 mắt ngủ và nuôi cấy trên môi trường MS + 20g sucrose + 10% ND + 0,5 mg/l BA + 0,5mg/l α-NAA + 6g agar/lít môi trường. Môi trường tạo cây hoàn chỉnh là RE + 10g sucrose + 6g agar + 0,3g THT + 0,5 mg/l α NAA.

Từ khóa: Dendrobium officinale Kimura et Migo., đoạn thân mang mắt ngủ, nhân nhanh, quả lan.


1. ĐẶT VẤN ĐỀ


Lan Dendrobium officinale Kimura et Migo. (Thạch hộc Thiết bì) có trong tự nhiên với nhiều giá trị dược học như chống ung thư, chống lão hóa, tăng sức đề kháng của cơ thể, làm dãn mạch máu và kháng đông máu, được sử dụng rộng rãi trong lâm sàng, làm các bài thuốc và đặc biệt là chữa bệnh tiểu đường, cao huyết áp (Kowitdamrong, 2013; Chu, 2014). Hiện nay Dendrobium officinale Kimura et Migo. phân bố rất phân tán và không liên tục do hậu quả của sự tàn phá môi trường sống bởi các hoạt động đốn gỗ và khai thác quá mức của con người đã khiến cho giống lan này tiệt chủng, trở thành loài có nguy cơ liệt vào danh sách các loài cần được bảo vệ (Gu, 2007). 

Nhiều loài lan quý hiếm bị đe dọa tuyệt chủng trong tự nhiên thường được bảo tồn nhờ phương thức nảy mầm từ hạt (Kauth, 2005). Với công nghệ nhân giống in vitro hiện nay, hệ số nhân giống từ một quả lan là rất lớn, từ vài ngàn đến một triệu cây con (Trần Văn Minh, 2001). Đã có các tác giả trong và ngoài nước nhân giống lan Dendrobium sp. bằng phương pháp gieo hạt lan trên nền môi trường MS có bổ sung 0,5mg/l NAA(Luan et al., 2006). Nguyễn Văn Song (2011) cũng nhân nhanh in vitro loài lan rừng có nguy cơ tuyệt chủng với nguồn nguyên liệu ban đầu là gieo hạt trên môi trường MS + 15% đường sacarose + 2,0 mg/l BA. Trong 3 năm gần đây Viện Sinh học Nông nghiệp đã thành công khi áp dụng công nghệ nuôi cấy mô nhân giống một số loài lan bản địa làm dược liệu thuộc chi Hoàng Thảo có nguy cơ bị tuyệt chủng (Nguyễn Thị Sơn và cs., 2012; 2013; Vũ Ngọc Lan và cs., 2013).

Để chủ động nguồn cây giống có chất lượng cao, sạch bệnh phục vụ cho phát triển sản xuất phục vụ nhu cầu nội tiêu cũng như xuất khẩu thì nhiệm vụ nhân giống lan bằng phương pháp nuôi cấy mô là hướng đi đúng đắn nhằm bổ sung thêm giống lan thuốc, đẩy mạnh phát triển loại lan dược liệu quý hiếm cho Việt Nam.


2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP


2.1. Vật liệu

Nghiên cứu được tiến hành trên giống Thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo.) từ Viện Sinh học Nông nghiệp - Học viện Nông nghiệp Việt Nam nghiên cứu thu thập tại Triết Giang - Trung Quốc. Sử dụng quả và đoạn thân in vitro mang mắt ngủ.

2.2. Phương pháp

Các thí nghiệm sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật (Gamborg and Phillips, 1995). Môi trường sử dụng trong thí nghiệm là Vacin & Went (1949), Murashige & Shoog (1962), Hyponex (N:P:K = 6,5:6:19), Robert Ernst (1979): 6,2 g/l agar, 10-20 g/l saccarose tùy từng giai đoạn của thí nghiệm và 100 mg/l inositol), có bổ sung các dịch nghiền: Nước dừa (ND), táo, chuối, khoai tây, cà rốt… hoặc chất điều tiết sinh trưởng tùy từng giai đoạn thí nghiệm. Cách làm dịch nghiền: quả táo đỏ, cà rốt để cả vỏ rửa sạch, chuối tiêu chín bỏ vỏ, xay nhỏ mịn riêng từng loại; khoai tây để cả vỏ rửa
sạch luộc chín dùng cả nước luộc xay nhỏ mịn. pH môi trường là 5,8. Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở 121 0C trong 20 phút ở áp suất 1atm. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, 3 lần nhắc lại. Mỗi lần nhắc lại 10 mẫu/công thức được đo đếm và quan sát định kỳ 2 tuần/lần.

Nhân giống từ hạt trên 3 loại môi trường Môi trường sử dụng trong thí nghiệm là Vacin & Went (1949), Murashige & Shoog (1962), Hyponex (N:P:K = 6,5:6:19), Robert Ernst (1979) để tạo nguồn vật liệu ban đầu. Xác định môi trường nền nhân nhanh cụm chồi và ảnh hưởng của dịch nghiền củ quả đến khả năng nhân nhanh chồi trên môi trường nền MS. Sử dụng các chồi thu được từ thí nghiệm trên cắt thành các đoạn thân mang 1-2-3-4 mắt ngủ và được đưa vào nuôi cấy trên môi trường nền MS để tìm hiểu ảnh hưởng của số đốt đến sinh trưởng của chồi. Sử dụng đoạn thân mang 2 mắt ngủ bổ sung kết hợp BA với NAA theo tỷ lệ khác nhau nhằm tăng khả năng sinh trưởng chồi. Các chồi thu được ở thí nghiệm trên được sử dụng cấy vào các nền môi trường khác nhau sau đó bổ sung NAA ở các nồng độ khác nhau để tạo cây hoàn chỉnh.

Các chỉ tiêu theo dõi tiến hành theo phương pháp nghiên cứu nông sinh học thông dụng: Tỷ lệ mẫu sống và phát sinh chồi, số lượng chồi trung bình (TB)/bình, số lượng chồi TB/cụm, hệ số nhân chồi, chiều cao chồi TB, số chồi TB, số lá TB, đường kính chồi TB, hình thái chồi, Tỷ lệ chồi tạo rễ, số rễ TB/chồi, chiều dài rễ TB.

2.3. Xử lý số liệu

Số liệu được phân tích phương sai (ANOVA) một nhân tố, phân tích hậu kiểm Fisher’s PLSD với mức P ≤ 0,05 bằng phần mềm Microsoft Excel, IRRISTAT 4.0 và SPSS 11.5

3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nhân giống bằng gieo hạt

3.1.1. Khử trùng quả lan

Nhiều công trình nghiên cứu trong nước vàthế giới trên đã công bố kết quả nghiên cứu khử trùng mẫu quả của các giống lan (Millner et al., 2008) (Hoàng Thị Nga và cs., 2008). Kế thừa các kết quả đó chúng tôi tiến hành khử trùng quả lan 5 tháng tuổi theo công thức: khử trùng bằng xà phòng → rửa dưới vòi nước chảy → rửa sạch quả lan bằng cồn → lắc đều trong dung dịch Johnson 15 phút (trong tủ cấy) → rửa lại 2 lần bằng nước cất (trong tủ cấy) → lắc đều trong dung dịch Johnson 3 phút (trong tủ cấy) → rửa lại 3 lần bằng nước cất (trong tủ cấy) → Gắp quả ra và xẻ lấy hạt cấy vào môi trường đã được chuẩn bị sẵn.

Quả lan sau khi được khử trùng, xẻ lấy hạt cấy vào các môi trường nền: MS (Murashige & Shoog, 1962), VW (Vacin & Went, 1949), Hyponex. Hạt lan mới gieo sẽ rất mịn và có màu vàng chanh. Sau 8 tuần nuôi cấy thu được kết quả ở bảng 1.

Bảng 1. Kết quả gieo hạt lan Dendrobium officinale Kimura et Migo

Ghi chú: +++: chất lượng tốt, màu xanh đậm; ++: chất lượng trung bình, màu xanh; +: chất lượng kém, màu xanh nhạt

Kết quả bảng 1 cho thấy gieo hạt lan trên 3 loại môi trường (MS, VW và H) sau 8 tuần nuôi cấy, các hạt đã nảy chồi 100% trên nền môi trường MS và VW. Hạt gieo trên nền môi trường VW cho tỷ lệ hạt có màu xanh cao nhất, sau 6 tuần nuôi cấy cho tỷ lệ mẫu phát sinh chồi cao nhất (100%). Hạt được gieo trên nền môi trường H cho tỷ lệ mẫu có màu xanh thấp nhất sau 8 tuần nuôi cấy.

Về hình thái, chồi tốt nhất trên môi trường nền VW (đồng đều màu xanh bóng, không bị xốp, không bị mọng nước, chồi phát triển mạnh không bị biến dị), tiếp đến là MS. Vì vậy, môi trường VW + 10g sucrose/lít môi trường + 6g agar/lít môi trường + 10% ND là môi trường thích hợp nhất
cho sự nảy mầm của hạt lan D. officinale Kimura et Migo.


            Vật liệu vào mẫu (Sau 4 tuần nuôi cấy)                     Mẫu gieo trên môi trường VW (8 tuần)


Hình 1. Kết quả gieo hạt lan Dendrobium officinale Kimura et Migo

3.1.2. Nhân nhanh cụm chồi

a. Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh cụm chồi

Việc xác định được môi trường tối ưu để nuôi cấy nhân nhanh chồi, làm tăng hệ số nhân, đồng thời các chồi đều đạt chất lượng tốt không bị biến dị trước khi chuyển sang môi trường tạo cây hoàn chỉnh là một yêu cầu không thể thiếu trong nhân in vitro. Mỗi công thức cấy 3 bình, mỗi bình thí nghiệm 5 cụm chồi có chiều cao 7mm, mỗi cụm có chứa 05 chồi.

Bảng 2. Ảnh hưởng của môi trường nền đến khả năng nhân nhanh cụm chồi (sau 4 tuần nuôi cấy)


Theo kết quả trình bày trên bảng 2 cho thấy: Các công thức khác nhau có ảnh hưởng khác nhau đến số chồi/cụm và hệ số nhân (HSN) chồi của giống lan nghiên cứu. Môi trường MS (CT1) rất phù hợp cho quá trình tăng nhanh về số lượng chồi (14,02 chồi/cụm) và HSN chồi (2,8 lần/4 tuần) trong nuôi cấy cụm chồi. Môi trường MS và VW cho số lượng chồi, HSN chồi thấp hơn so với nền môi trường MS lần lượt là (12,29 chồi/cụm; 2,46 lần/4 tuần) và (12,09 chồi/cụm; 2,42 lần/4 tuần). Môi trường VW (CT4) cho số chồi/cụm (10,49 chồi) và HSN (2,1 lần) là thấp nhất sau 4 tuần nuôi cấy. Ở độ tin cậy 95%, số chồi/cụm và HSN chồi ở CT1 sai khác có ý nghĩa so với các công thức khác. Như vậy, môi trường nuôi cấy được lựa chọn trong nhân nhanh cụm chồi lan D. officinale Kimura et Migo. là môi trường MS + 20g sucrose + 10% nước dừa + 6g agar/lít môi trường.

b. Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nghiền củ, quả đến khả năng nhân nhanh cụm chồi

Cấy vào mỗi bình thí nghiệm 5 cụm chồi có chiều cao 7mm, mỗi cụm có chứa 05 chồi được đưa vào nuôi cấy trên nền môi trường MS có bổ sung các dịch nghiền (khoai tây, cà rốt, táo, chuối) qua đó xác định được ảnh hưởng của các chất bổ sung này đến khả năng nhân nhanh của cụm chồi. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.


Hình 2. Kết quả nhân nhanh chồi trên các môi trường nền (sau 4 tuần nuôi cấy)

Bảng 3. Ảnh hưởng của dịch nghiền củ, quả đến khả năng nhân nhanh cụm chồi (sau 8 tuần)
Ghi chú: ++, +: Sắc xanh vừa, xanh nhạt của cụm chồi; a: Thân mập; b: Thân trung bình; c: Thân mảnh; ĐC = Môi trường MS + 100ml ND+ 20g sucrose + 6g agar/lít môi trường

Kết quả cho thấy ở các công thức bổ sung riêng lẻ các dịch nghiền vào môi trường nuôi cấy thì CT5 (60 gam chuối chín/lít môi trường) cho số chồi TB/cụm nhiều nhất (16,20 chồi/cụm) và HSN chồi cao nhất (đạt 3,24 lần). Các công thức có bổ sung kết hợp các dịch nghiền vào môi trường nuôi cấy không cho kết quả vượt trội theo tính cộng hợp mà ở các công thức từ CT6- CT11 đều cho các chỉ tiêu số chồi/cụm và HSN chồi thấp hơn CT5. Điều này cho thấy việc kết hợp các chất tự nhiên vào cùng môi trường nhân chồi không mang lại hệ số nhân chồi tăng cao như mong muốn. Ở độ tin cậy 95%, số chồi/cụm thu được và HSN chồi đạt được sau 8 tuần nuôi cấy ở công thức 5 cao hơn so với các công thức khác. Môi trường MS + 100ml ND + 20g sucrose + 6g agar + 60g chuối chín/lít môi trường là tối ưu cho nhân nhanh cụm chồi loài lan nghiên cứu. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Vũ Ngọc Lan và cs., (2013) khi nhân nhanh cụm chồi lan thuốc D.nobile Lindl. Kết quả nghiên cứu trên lan hài Hằng (P. hangianum Gurss.) khi nhân nhanh chồi cho biết cần bổ sung lượng chuối cao hơn, lên đến 100g chuối/lít môi trường (Hoàng Thị Giang và cs., 2010).

3.2. Nhân giống vô tính thông qua nuôi cấy đoạn thân in vitro mang mắt ngủ

3.2.1. Ảnh hưởng của số đốt trên đoạn thân in vitro đến sinh trưởng chồi

Cây lan in vitro được cắt thành những đoạn mang 1-2-3-4 mắt ngủ và được đưa vào nuôi cấy trên môi trường nền MS để tìm hiểu ảnh hưởng của số đốt trên đoạn thân in vitro đến sinh trưởng của chồi.

Kết quả cho thấy các đoạn thân mang mắt ngủ đều tái sinh chồi. Đoạn thân mang 2 mắt ngủ cho sinh trưởng mạnh nhất, thể hiện qua chiều cao chồi, đường kính chồi, số chồi và màu sắc lá xanh tốt hơn hẳn so với các công thức còn lại. Do đó, thân mang 2 mắt ngủ được chọn để bố trí thí nghiệm tiếp theo.

Bảng 4. Ảnh hưởng của số trên đoạn thân đến sinh trưởng chồi in vitro (sau 8 tuần)

3.2.2. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến sinh trưởng của đoạn thân mang 2 mắt ngủ in vitro

Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái trong các hệ thống nuôi cấy. Sự kết hợp auxin và cytokinin với một tỷ lệ nhất định đôi khi không những cải thiện được khả năng tái sinh mà còn làm tăng sự sinh trưởng của chồi. Do vậy, nghiên cứu này tiến hành thử nghiệm các công thức tạo sự phát sinh hình thái với các tổ hợp của BA và NAA ở các nồng độ khác nhau.

Kết quả bảng 5 cho thấy, bổ sung nồng độ BA kết hợp với αNAA hợp lý vào môi trường nuôi cấy là rất hiệu quả cho tái sinh chồi giống lan nghiên cứu từ đoạn thân mang mắt ngủ. Tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái, tạo chồi, số chồi/mẫu và chiều cao chồi thu được trên môi trường chứa BA và αNAA cao hơn so với công thức đối chứng. Sau thời gian 8 tuần đều có sự khác nhau về giá trị của các chỉ tiêu nghiên cứu. Môi trường MS có bổ sung BA (0,5 mg/l môi trường) + αNAA (0,2 mg/l môi trường) tốt nhất cho việc phát sinh hình thái chồi; chiều cao chồi; số chồi; số lá/chồi. Chiều cao chồi là 6,26cm; số chồi trung bình/đoạn thân là 8,00; số lá trung bình là 8,10 lá/chồi, lá có màu xanh đậm, mập. Như vậy, môi trường MS + 20g sucrose + 10% ND + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l α-NAA+ 6g agar/lít môi trường là thích hợp cho việc phát sinh chồi giống lan D. officinale Kimura et Migo. tương tự với kết quả của Li (2012) khi nghiên cứu nhân nhanh giống lan này tại Trung Quốc.

Bảng 5. Ảnh hưởng của BA + NAA đến sinh trưởng của đoạn thân mang 2 mắt ngủ in vitro (sau 8 tuần)

Ghi chú: ĐC = Môi trường MS + 20g sucrose + 10% nước dừa (ND)+ 6g agar/lít môi trường



Hình 3. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến sinh trưởng của đoạn thân mang 2 mắt ngủ in vitro (sau 8 tuần)
3.3. Tạo cây hoàn chỉnh

3.3.1. Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo rễ của chồi

Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình nhân nhanh in vitro. Với mục đích tạo cây con có sức sống cao, đạt tiêu chuẩn ra cây. Tiến hành lấy chồi thu được từ các thí nghiệm trên tách riêng rẽ cấy trên 7 môi trường nền khác nhau, mỗi công thức cấy 3 bình, mỗi bình cấy 5 chồi, mỗi chồi có chiều cao 3cm, 3 lá. Kết quả sau 30 ngày nuôi cấy được thể hiện qua bảng 6.

Bảng 6. Ảnh hưởng của nền môi trường đến khả năng ra rễ của chồi (sau 30 ngày nuôi cấy)
Ghi chú: D là ngày

Kết quả bảng 6 cho thấy: sau 30 ngày nuôi cấy, ở tất cả các công thức với nền môi trường khác nhau đều cho tỷ lệ chồi tạo rễ là 100%. Trên nền môi trường RE (CT5) cho số rễ nhiều nhất là 3,53 rễ/chồi. Về chỉ tiêu chiều dài trung bình/rễ, nuôi cấy trên môi trường RE cũng cho giá trị cao hơn so với các môi trường khác là 2,8cm. Vậy, nuôi cấy chồi lan D. officinale Kimura et Migo. trên môi trường RE + 10g sucrose + 6g agar + 0,3g THT/lít môi trường là tối ưu để tạo cây hoàn chỉnh.

3.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng sinh rễ của chồi

Đối với nuôi cấy mô và tế bào thực vật, auxin được sử dụng để kích thích phân chia tế bào và phân hóa rễ. Những auxin thường dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là αNAA, IAA… Để tăng khả năng ra rễ cho chồi giống lan D. officinale Kimura et Migo. chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm với 5 công thức trên nền môi trường RE có bổ sung nồng độ α-NAA khác nhau. Sau 30 ngày nuôi cấy và theo dõi thu được kết quả như sau:

Bảng 7. Ảnh hưởng của αNAA đến khả năng ra rễ của chồi (sau 30 ngày nuôi cấy)

Ghi chú: ĐC = Môi trường RE + 10g sucrose+ 6g agar + 0,3g THT/lít môi trường); D: ngày


Hình 5. Kết quả ra rễ của chồi lan Dendrobium officinale Kimura et Migo. trên môi trường RE có bổ sung αNAA (sau 30 ngày nuôi cấy)

Các công thức có bổ sung αNAA và ĐC sau 10 ngày nuôi cấy đều cho số chồi tạo rễ đạt 100% nhưng số rễ/cây và chiều dài rễ ở các công thức khác nhau là khác nhau. Ở CT3 có bổ sung 0,5mg αNAA/lít môi trường nuôi cấy cho số rễ nhiều nhất là 4,51 rễ/chồi và chất lượng rễ là tốt nhất. Tuy nhiên, trên môi trường có bổ sung αNAA nhiều hơn (CT4, CT5) hoặc ít hơn (CT2) thì cây có số rễ ít hơn và chất lượng rễ kém hơn. Vậy, trên môi trường RE +10g sucrose+ 6g agar + 0,3g THT/lít môi trường bổ sung 0,5mg αNAA/lít môi trường vào môi trường nuôi cấy chồi lan D. officinale Kimura et Migo. là tối ưu để tạo cây hoàn chỉnh.

4. KẾT LUẬN


Môi trường VW + 10g sucrose + 6g agar + 100ml ND/lít môi trường là tối ưu ở giai đoạn nuôi cấy khởi động hạt lan D. officinale Kimura et Migo., tỷ lệ hạt nảy mầm là 100%. Môi trường nuôi cấy tối ưu để nhân nhanh cụm chồi giống lan D. officinale Kimura et Migo. là MS + 100ml ND + 20g sucrose + 6g agar + 60g chuối chín/lít môi trường, hệ số nhân chồi đạt 2,8 lần/sau 4
tuần nuôi cấy.

Nhân giống vô tính thông qua nuôi cấy đoạn thân mang mắt ngủ: Đoạn thân in vitro mang 2 mắt ngủ và nuôi cấy trên môi trường MS + 20g sucrose + 10% ND + 0,5 mg/l BA + 0,5mg/l αNAA+ 6g agar/lít môi trường là thích hợp cho chiều cao chồi là 6,26cm; số chồi trung bình/đoạn thân là 8; số lá trung bình là 8,10 lá/chồi, lá có màu xanh đậm, mập.
  
Môi trường RE + 10g sucrose+ 6g agar+ 0,3g THT + 0,5 αNAA/lít môi trường là tối ưu ở giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh giống lan D. officinale Kimura et Migo. với tỷ lệ cây ra rễ đạt 100%, số rễ trung bình là 4,51 rễ/chồi; chiều dài rễ trung bình là 3,19cm sau 30 ngày nuôi cấy.

TÀI LIỆU THAM KHẢO


Hoàng Thị Giang, Nguyễn Quang Thạch, Mạch Hồng Thắm, Đỗ Thị Thu Hà (2010). Nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi trồng giống lan hài quý P. hangianum perner Gurss (Hài Hằng) thu thập ở
Việt Nam. Tạp chí Khoa học và Phát triển, 8(2): 194-201.

Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Thị Lý Anh (2013). Nhân giống in vitro loài lan bản địa Dendrobium nobile Lindl. Tạp chí Khoa học và Phát triển, 11(7): 917-925.

Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển (2001). Vi nhân giống phong lan nhóm Dendrobium trên quy mô
công nghiệp, nhân giống in vitro. Tạp chí Khoa học Công nghệ, 1: 9.

Hoàng Thị Nga, Nguyễn Quang Thạch, Đỗ Đức Thịnh, Hoàng Minh Tú (2008). Xây dựng quy trình nhân nhanh giống địa lan Hồng hoàng (Cymbidium iridioides) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô. Tạp chí
Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp, 4: 387-394.

Nguyễn Văn Song và cs. (2011). Nhân nhanh in vitro lan Kim Điệp (Dendrobium chrysotoxum) - một loài lan rừng có nguy cơ tuyệt chủng. Tạp chí khoa học ĐH Huế, 64: 127-136.

Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Thị Lý Anh, Vũ Ngọc Lan, TrầnThế Mai (2012). Nhân giống in vitro loài lanDendrobium fimbriatum Hook. (Hoàng Thảo Longnhãn). Tạp chí Khoa học và Phát triển, 10(2): 263 - 271

Nguyễn Thị Sơn, Trần Thế Mai, Hoàng Thị Nga,Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Quang Thạch (2013).
Nghiên cứu ứng dụng hệ thống bioreactor plantima trong nhân giống loài lan Hoàng Thảo Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindl.). Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 2: 28-34.

Anjum S, Zia M and Chaudhary MF (2006). Investigation of diffirent strategies for high frequency regeneration of Dendrobium malones “Victory”. Afican Journal of Biotechnology, 5(19):
1738-1743

Chu Chu, Huimin Yin, Li Xia, Dongping Cheng, Jizhong Yan, and Lin Zhu (2014). Discrimination of
Dendrobium officinale and Its Common Adulterants by Combination of Normal Light and Fluorescence Microscopy. Molecules, 19(3): 3718-3730.

Helen J. Millner, Abraham Obeng, Alison R. McCrea, and Timothy C. Baldwin (2008). Axenic seed germination and in vitro seedling development of Restrepia brachypus (Orchidaceae). Journal of the
Torrey Botanical Society, 135(4): 497-505.

Kalimuthu K, Senthikumar R and Vijaykumar S (2006). In vitro micropropagation of orchid,
Oncidium sp. (Dancing Dolls). Afican Journal of Biotechnology, 6(10): 1171-1174. 

Kauth P. (2005). In vitro seed germination and seedling development of Calopogon tuberosus and Sacoila lanceolata var. lanceolata: Two Florida native terrestrial orchids, Master thesis, University of
Florida Kowitdamrong, A.; Chanvorachote, P.; Sritularak, B.; Pongrakhananon, V. (2013). Moscatilin inhibits lung cancer cell motility and invasion via suppression of endogenous reactive oxygen
species. Biomed. Res. Int., 765894.

Luan VQ, Thien NQ, Khiem DV and Nhut DT (2006). In vitro germination capacity and pant recover of some native and rare orchids, Processding of Internation Workshop on Biotechnology of
Agriculture, p. 175-177. Li Hong -lin, Zan Yan-yan, Yang Bo (2012).

Tissue culture of Dendrobium officinale Kimura et Migo., Subtropical Plant Science , 41(3): 76-77.
McKendrick (2000). In vitrogermination of orchids: a manual, Ceiba Foundation for Tropica
Conservation, p. 1-17 

S.Gu, X. Y. Ding, Y. Wang, Q. Zhou, G. Ding, X. X. Li and Qian (2007). Isolation and characterization of microsatellite markers in Dendrobium officinale,an endangered herb endemic to China. MolecularEcology Notes, 7: 1166-1168.

Nguồn: Nguyễn Thị Sơn và ctv. NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN DENDROBIUM OFFICINALE KIMURA ET MIGO (THẠCH HỘC THIẾT BÌ).Tạp chí Khoa học và Phát triển 2014, tập 12, số 8: 1274-1282

GIÁ TRỊ DƯỢC LIỆU CỦA CÂY LAN THẠCH HỘC TÍA DENDROBIUM OFFICINALE



TÓM TẮT


Thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale) là một loài thuộc chi Dendrobium, họ lan (Orchidaceae). Ngoài giá trị thẩm mỹ, nó còn có giá trị dược liệu, được sử dụng phổ biến trong nền y học cổ truyền của nhiều nước châu Á. Theo các tài liệu dược học cổ truyền, thạch hộc thiết bì có tác dụng bổ âm, tân sinh, chữa chứng hỏa hư, trị đau dạ dày, đau thượng vị, bồi bổ đôi mắt, chống lão hóa… Các nghiên cứu gần đây khẳng định giá trị dược học của loại thảo dược này về khả năng kháng khuẩn, chống oxy hóa, tăng cường hệ miễn dịch, ức chế tế bào ung thư, điều hòa đường huyết, cải thiện hoạt động của hệ tiêu hóa, ổn định hệ vi sinh đường ruột…

Từ khóa: thạch hộc thiết bì, phong đấu, dược liệu, Dendrobium


1. GIỚI THIỆU


Ngày nay, việc sử dụng các loại thực phẩm cũng như các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật trong công tác phòng trị bệnh, làm thực phẩm chức năng được các nước trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng rất quan tâm. Nhờ có nguồn gốc tự nhiên, cơ thể con người dễ dung nạp, hòa hợp và có những ưu điểm riêng. Hầu hết các vị thuốc trong y học cổ truyền đã được sử dụng từ rất lâu, đều đã được sàng lọc qua nhiều thế hệ. Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, những hiểu biết về thành phần hóa học, tác dụng dược lý cũng như cơ chế tác dụng của các loại thảo dược ngày càng được củng cố.

Họ lan (orchidaceae) từ lâu đã được biết đến nhờ giá trị về mặt thẩm mỹ. Bên cạnh đó, nhiều loài trong họ thực vật này cũng có giá trị dược liệu, đóng góp rất nhiều vào nền y học cổ truyền của nhiều
nước trên thế giới. Bài viết tổng hợp các tài liệu nghiên cứu về giá trị dược liệu của cây lan Thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale), một loại thực vật dược quý giá.


2. VỊ THUỐC THẠCH HỘC


Theo Đỗ Tất Lợi [1] thì Thạch hộc (Caulis Dendrobii) là thân phơi hay sấy khô của nhiều loài Thạch hộc hay Hoàng thảo như  Dendrobium nobile, D. simplicissimum, D. dalhousieanu D. gratiosissimum, D. crumenatum, D. officinale…

Dendrobium nobile là loài cây phụ sinh trên những cành cây thật cao, thân mọc thẳng đứng cao độ 0,3-0,6 m, thân hơi dẹt, phía trên hơi dày hơn, có đốt dài 2,5-3 cm, có vân dọc. Lá hình thuôn dài, phía cuống tù, gần như không cuống, ở đầu hơi cuộn hình nón, dài 12 cm, rộng 2-3 cm trên có 5
gân dọc. Cụm hoa mọc thành chùm 2-4 hoa trên những cuống dài 2-3 cm. Hoa rất đẹp, to, màu hồng hay điểm hồng. Cánh môi hình bầu dục nhọn, dài 4-5 cm, rộng 3 cm cuộn thành hình phễu trong hoa, ở nơi họng hoa điểm màu tía

Thạch hộc hái về, cắt bỏ rễ con, lá phơi hoặc sấy khô hoặc cho vào chảo, đổ nước cho ngập rồi sàng ít vôi bột vào, đun sôi cho chín thạch hộc thì vớt ra, đem phơi cho hơi khô thì đem vào nhà lăn đi lăn lại cho tới khi bong hết vôi, các vẩy và lá

Thạch hộc thường được dùng chữa những bệnh sốt nóng, khô cổ, khát nước, người háo, bứt rứt khó chịu. Theo đông y, thạch hộc dưỡng âm sinh tân, dùng trong các bệnh tân dịch bất túc như miệng khô, cổ họng khô hay do tân dịch không đủ mà không muốn ăn, mắt nhìn kém, khớp xương sưng đau hay không có lực. Theo tài liệu cổ, thạch hộc vị ngọt, nhạt, tính hơi lạnh, vào 3 kinh phế, vị và thận. Có tác dụng dưỡng âm, ích vị sinh tân. Dùng chữa bệnh sốt, tân dịch khô kiệt. Một số đơn thuốc có
thạch hộc như:

1. Đơn thuốc chữa chứng ho, đầy hơi: thạch hộc 6 g, mạch môn 4 g, tỳ bà diệp 4 g, trần bì 4 g, nước 300 ml, sắc còn 200 ml. Chia lần 3 lần uống trong ngày.

2. Đơn thuốc chữa chứng hư lao, người gầy mòn: thạch hộc 6 g, mạch môn đông 4 g, ngũ vị tử 4 g, đảng sâm 4 g, trích cam thảo 4 g, câu kỷ tử 4 g, ngưu tất 4 g, đỗ trọng 4 g, nước 300 ml, sắc còn 200 ml.Chia lần 3 lần uống trong ngày.

3. CÂY LAN THẠCH HỘC THIẾT BÌ


Thạch hộc thiết bì có tên khác là thạch hộc tía, thạch hộc rỉ sắt thường sinh trưởng ở các vách đá, khe đá, hoặc phụ sinh trên cây cổ thụ, ở vùng cao núi đá, nhiệt đới, á nhiệt đới, độ cao từ 800-1000 m. Vỏ thân và biểu bì phiến lá có màu rỉ sắt hoặc đốm tím nên đặt tên là “thạch hộc rỉ sắt”. Thân cao 30-50 cm, thường mọc thành khóm nhiều giả hành. Lá mọc so le đều hai bên thân, thuôn dài, hầu như không cuống. Hoa to 4-4,5 cm xếp thành bó 2-4 cái ở sát nách lá, hoa tháng 3-4, quả tháng 5-6. D. officinale đứng đầu trong sách Thần Nông, công trình dược học đầu tiên của Trung Hoa cổ đại về các cây thuốc quý, được coi là thứ đứng đầu trong chín loại tiên dược trong kinh điển Đạo gia từ 1000 năm trước. Nó cũng được ghi trong Dược điển Trung Quốc 2010; giá trị sản lượng của Thạch hộc thiết bì đạt hàng tỷ NDT năm 2011. Thạch hộc thiết bì được chế biến thành phong đấu (TiepiFengdou) là một trong những thực phẩm chức năng được sản xuất và bán nhiều nhất ở Trung Quốc [2].


Dendrobium officinale và phong đấu 

Theo y học cổ truyền Trung Quốc, Thạch hộc thiết bì tốt cho bổ âm sinh dịch, chữa chứng hỏa hư, trị đau dạ dày, đau thượng vị, bồi bổ đôi mắt. Ngoài ra, nó còn có tác dụng chống ung thư, chống lão hóa, tăng sức đề kháng của cơ thể, làm dãn mạch máu và kháng đông máu, được sử dụng rộng rãi trong lâm sàng, làm các bài thuốc và đặc biệt là chữa bệnh tiểu đường, cao huyết áp [3].

Theo Dược điển Trung Quốc thì trong D. officinale có dendrobium polysaccharides (23%), alkaloids (0,02-0,04%), amino-acids (135 mg/g cây khô), nhiều kim loại như Sắt (292 mcg/g), Kẽm (12 mcg/g), Mangan (52mcg/g), Đồng (3,6 mcg/g).

4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU DƯỢC HỌC HIỆN ĐẠI VỀ THẠCH HỘC THIẾT BÌ


Những nghiên cứu khoa học ghi nhận D. officinale và các polysaccharide trong cây cải thiện, tăng cường sức đề kháng tế bào khi thử trên chuột. Nghiên cứu của Liu, X. F. và cs (2011) cho thấy khi cho chuột uống dịch chiết và các polysaccharide thô của D. officinale giúp tăng cường đáng kể khả năng miễn dịch tế bào và miễn dịch không đặc hiệu ở chuột, tăng sản sinh IFNgamma ở lách [4].

Polysaccharide của D. officinale gồm 6 monosaccharide: mannose, glucose, galactose, arabinose, xylose và acid glucuronic có khả năng ức chế sự thâm nhiễm của tế bào lympho và quá trình apoptosis, giúp cân bằng các cytokine ở tuyến dưới hàm, có vai trò hỗ trợ điều trị hội chứng Sjogren (Sjogren's syndrome (SS), một bệnh tự miễn toàn thân trong đó các tế bào miễn dịch tấn công và phá hủy các tuyến ngoại tiết sản xuất nước mắt và nước bọt, gây khô mắt và khô miệng) [5-8]. 

Linjing Xia và cs (2012), Meng L. Z. và cs (2013) nghiên cứu hoạt tính điều hòa miễn dịch của D. officinale cho thấy khả năng tăng sinh tế bào lách, tăng cường hoạt động của tế bào NK, khả năng thực bào và tiết oxide nitric của đại thực bào, cũng như sự tiết các cytokine như IL-1alpha, IL-6, IL-10 và TNF alpha của tế bào lách và đại thực bào trong thử nghiệm in vitro dịch chiết polysaccharide thô [9-10].

Nghiên cứu của Peng Cao và cs (2013) cho thấy tác dụng của bài thuốc “Pingliu Keli” (PK) (trong thành phần có dược liệu Thạch hộc thiết bì) trong việc gây độc dòng tế bào ung thư thần kinh ở người SHG-44 trong điều kiện in vitro. Tỷ lệ sống của tế bào SHG-44 giảm xuống dưới 20% khi xử lý bằng PK ở nồng độ 90 μg/ml trong 24h[11].

Nghiên cứu tác dụng của D. officinale trên hệ tiêu hóa cho thấy một polysaccharide (Dendronan) có tác dụng tốt, giúp điều hòa hệ vi sinh đường ruột, tăng hàm lượng các acid béo chuỗi ngắn SCFA, giảm pH ruột kết và thời gian hình thành phân [12].

Các polysaccharide từ D. officinale cũng có tác dụng kháng khuẩn. Thử nghiệm trên E. coli cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu MIC là 0,5% và đường kính vòng ức chế là 15,8 mm. Ngoài ra, nó cũng có tác dụng hiệu quả đối với Bacillus subtilis [13].

Hoạt tính chống oxy hóa của các polysaccharide tổng DCPP và polysaccharide tinh chế DCPP3c-1 (trích từ môi trường cấy mô protocorm D. officinale) đã được chứng minh qua các thử nghiệm in vitro. DCPP và DCPP3c-1có thể ức chế sự oxy hóa tế bào gan, sự peroxy hóa lipid ở ti thể tế bào gan [14].

Dịch chiết từ D. candium (D. officinale) có hoạt tính làm hạ đường khi thử trên chuột bị gây tăng đường trong máu bằng adrenaline và bằng streptozotocin do cách tác động kích thích sự bài tiết insulin từ tế bào beta, đồng thời ngăn sự bài tiết glucagon từ tế bào alpha, ngoài ra còn làm giảm sự phân hủy của glycogean trong cơ thể, làm tăng tổng hợp glycogen trong gan [15].

Ngoài ra, D. officinale là một trong 5 dược thảo có chứa chrysotoxene, erianin và confusarin là những chất có hoạt tính diệt bào khi thử (in vivo và in vitro) trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau [16].

TÀI LIỆU THAM KHẢO


[1] Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, 2003, NXB Y Học.
[2] Dai Yan Ping, Research On Good Agricultural Practices Of Dendrobium Officinale, in
Agricultural extension. 2012, Zhejiang Forestry University.
[3] Chu, C., et al., Discrimination of Dendrobium officinale and Its Common Adulterants by
Combination of Normal Light and Fluorescence Microscopy. Molecules, 2014. 19(3): p. 3718.
[4] Liu, X.F., et al., Orally administered Dendrobium officinale and its polysaccharides enhance
immune functions in BALB/c mice. Nat Prod Commun, 2011. 6(6): p. 867-70.
[5] Lin, X., et al., Dendrobium officinale polysaccharides ameliorate the abnormality of aquaporin
5, pro-inflammatory cytokines and inhibit apoptosis in the experimental Sjogren's syndrome
mice. Int Immunopharmacol, 2011. 11(12): p. 2025-32.
[6] Lin, X., Protective effect of dendrobium officinale polysaccharides on experimental model of
Sjögren's syndrome, in HKU Theses Online (HKUTO). 2011, The University of Hong Kong
(Pokfulam, Hong Kong).
[7] Xiang, L., et al., Polysaccharides of Dendrobium officinale inhibit TNF-alpha-induced
apoptosis in A-253 cell line. Inflamm Res, 2013. 62(3): p. 313-24.
[8] Lin, X., et al., Polysaccharides of Dendrobium officinale induce aquaporin 5 translocation by
activating M3 muscarinic receptors. Planta Med, 2015. 81(2): p. 130-7.
[9] Xia, L., et al., Partial characterization and immunomodulatory activity of polysaccharides from
the stem of Dendrobium officinale (Tiepishihu) in vitro. Journal of Functional Foods, 2012. 4(1):
p. 294-301.
[10]Meng, L.Z., et al., Effects of polysaccharides from different species of Dendrobium (Shihu) on
macrophage function. Molecules, 2013. 18(5): p. 5779-91.
[11]Cao, P., et al., Growth Inhibition and Induction of Apoptosis in SHG-44 Glioma Cells by
Chinese Medicine Formula "Pingliu Keli". Evid Based Complement Alternat Med, 2011. 2011:
p. 1-9
[12]Zhang, G.Y., et al., Study on Dendrobium officinale O-Acetyl-glucomannan (Dendronan). 7.
Improving Effects on Colonic Health of Mice. J Agric Food Chem, 2015.
[13]Lei, L., D. ChangChun, and L. FuHui, Study on the antibacterial effects of two Dendrobium
polysaccharides. Medicinal Plant 2011. 2(2): p. 21-22.
[14]He, T.G., et al., Antioxidant Activity of Crude and Purified Polysaccharide from SuspensionCultured
Protocormns of Dendrobium candidum in Vitro. Chinese Traditional Patent Medicine,
2007. 29(9): p. 1265-1269.
[15]Wu, H.S., et al., Studies on anti-hyperglycemic effect and its mechanism of Dendrobium
candidum. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 2004. 29(2): p. 160-3.
[16]Yao, C., et al., eds. Functional foods based on traditional chinese medicine. Functional foods
based on traditional chinese medicine, nutrition, well-being and health., ed. J. ouayed. 2012.

Nguồn: Nguyễn Thanh Thuận (2015). GIÁ TRỊ DƯỢC LIỆU CỦA CÂY LAN THẠCH HỘC TÍA (DENDROBIUM OFFICINALE). Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số 6 (25)

NHÂN GIỐNG IN VITRO LOÀI LAN BẢN ĐỊA DENDROBIUM NOBILE LINDL



TÓM TẮT


Nghiên cứu nhân giống in vitro Lan Dendrobium nobile Lindl. (Thạch hộc) nhằm mục đích để bảo tồn và phát triển loài lan quý chi Hoàng thảo, có giá trị thẩm mỹ và dược liệu cao, đang có nguy cơ tuyệt chủng. Kết quả cho thấy nguyên liệu sử dụng thích hợp là quả lan 5 tháng tuổi; môi trường gieo hạt là MS + (100ml ND + 10g saccharose + 6,0g agar)/lít môi trường. Trong nhân in vitro kinh điển, môi trường nhân nhanh protocorm tối ưu là KC+ (100ml ND + 10g saccharose + 6,0g agar)/lít; nhân nhanh cụm chồi tốt nhất là MS+ (100ml ND + 10g saccharose + 6,0g agar)/lít. Trong nhân in vitro cải tiến: nuôi cấy lỏng lắc nút bông và lỏng lắc màng thoáng khí đã tăng hệ số nhân protocorm đạt 1,9 và 2,3 lần so với nhân in vitro kinh điển. Nuôi cấy đặc thoáng khí giúp giảm 25% lượng saccharose bổ sung vào môi trường và tăng hệ số nhân protocorm lên gấp 1,4 lần so với nuôi cấy kinh điển. Nhân nhanh cụm chồi bằng kỹ thuật bioreactor giảm ½ thời gian nhân giống. Môi trường tối ưu tạo cây hoàn chỉnh là RE+ (10g saccharozase + 0,5g THT)/lít, cường độ ánh sáng 2300lux.

Từ khóa: Dendrobium nobile Lindl., quả lan, nhân nhanh, protocorm.

1. ĐẶT VẤN ĐỀ


Trên thế giới chi Lan Hoàng Thảo (Dendrobium) có khoảng 1400 loài, chủ yếu phân bố ở Đông Nam Á và các đảo thuộc Philippine, Malaysia, Indonesia, Papua New Guinea, Đông Bắc Australia. Ở Việt Nam có 107 loài và 1 thứ, phân bố ở các vùng núi từ Bắc vào Nam và trên một số đảo ven biển (Đào Thị Thanh Vân, Đặng Thị Tố Nga, 2008). Tuy nhiên, do nhiều nguyên nhân khác nhau, đến nay nhiều loài đã bị tuyệt chủng hoặc bị đe dọatuyệt chủng. Một số loài nằm trong danh lục Đỏ của “Sách đỏ Việt Nam”, trong đó có loài lan Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindl.) phân bố ở vùng trung du miền núi phía Bắc Việt Nam (Dương Đức Huyến, 2007). Để bảo tồn và phát triển loài lan quý hiếm này, không còn cách nào khác là phải tiến hành nhân giống và nuôi trồng chúng ở quy mô lớn (Nguyễn Tiến Bân, 2007; Dương Đức Huyến, 2007). 

Hiện nay, một số loài lan quý hiếm bị đe dọa tuyệt chủng trong tự nhiên đã được bảo tồn nhờ phương thức nảy mầm từ hạt (Kauth, 2005) hoặc nhân nhanh in vitro với nguồn nguyên liệu ban đầu là hạt gieo trên môi trường MS + 15% đường saccharose + 2,0mg/l BA (Nguyễn Văn Song, 2011). Theo Lê Văn Hoàng (2008), phương pháp nuôi cấy mô là phương pháp duy nhất có thể nhân giống lan cho hệ số nhân cao, số lượng cây giống lớn và giá thành hợp lý. Tuy nhiên, cho đến nay ở nước ta, nghiên cứu nhân giống và nuôi trồng chi lan Hoàng thảo chủ yếu với các giống lan lai nhập nội nhằm sản xuất hoa cắt cành hay trồng chậu làm cây cảnh. Việc nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, đặc biệt nuôi cấy mô cải tiến (kỹ thuật nuôi cấy lỏng lắc nút bông và nuôi cấy lỏng lắc thoáng khí) với loài lan rừng bản địa D. nobile Lindl. chưa được đề cập đến (Trần Văn Huân và Văn Tích Lượm, 2007). Chính vì vậy, mục đích của nghiên cứu này là nhân nhanh quy mô công nghiệp cây giống D. nobile Lindl. phục vụ công tác bảo tồn và phát triển nguồn gen dược liệu quí bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào kinh điển và cải tiến trong các môi trường không sử dụng chất điều tiết sinh trưởng nhân tạo.

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP


2.1. Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu được đưa vào nuôi cấy mô là chồi mầm và quả của những cây lan rừng thuộc loài Dendrobium nobile Lindl. 5 tháng tuổi thu thập tại Hòa Bình, đang được nuôi trồng tại Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường ĐH Nông Nghiệp Hà Nội (Hình 1). Mẫu nghiên cứu là protocorm, cụm chồi, chồi. Hóa chất, vật tư thí nghiệm gồm: H2O2 2%, HgCl2 0,1%, than hoạt tính. Môi trường: Vacin and Went, 1949 (VW); KnudsonC, 1965 (KC); Murashige-Skoog, 1962 (MS); Robert Ernst, 1979 (RE).


Hình 1. Loài lan D. nobile Lindl.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

Mẫu nuôi trong thời gian chiếu sáng 12h/ngày, cường độ ánh sáng 800-2.300lux, nhiệt độ phòng nuôi 25±2 oC; pH môi trường 5,8. Môi trường nuôi cấy được khử trùng ở nhiệt độ 121oC; 1,5at trong 20 phút. Hệ thống bioreactor Biostat Bplus (Sartorius sản xuất), bình nuôi có thể tích tối đa 10 lít; màng lọc thoáng khí (Cellulose Acetate, kích thước lỗ 0,2µm); Nút bông được bọc ngoài bằng mũ giấy xi măng; máy lắc ngang đặt vận tốc 200 vòng/phút, cường độ chiếu sáng 800lux. Các thí nghiệm được bố trí theo phương pháp nuôi cấy mô quy chuẩn thông hành, khối hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. Một công thức bố trí 15 bình thủy tinh dung tích 250ml. Riêng thí nghiệm về ảnh hưởng của các phương thức nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh cụm chồi, môi trường nuôi cấy gồm MS + (100ml ND+60g chuối chín + 30g saccaroza)/lít (đối chứng) và 4 công thức: Công thức 1, 2 và 3: 80ml môi trường nhân chồi/bình, 05 bình/công thức, 03 cụm/bình, 15 chồi/cụm, màng lọc thoáng khí cellulose acetate. Công thức 4: 03 lần nhắc lại, 04 lít môi trường nhân chồi/bình, 150 cụm/bình, 15 chồi/cụm. Hệ thống bioreactor ở chế độ cánh khuấy tròn 200 vòng/phút, cường độ chiếu sáng 800lux.

Các chỉ tiêu theo dõi thông thường trong nuôi cấy mô, chỉ tiêu tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu phát sinh protocorm, số chồi/ cụm, hệ số nhân chồi, đường kính cụm chồi, hình thái chồi, số lượng protocorm/cụm, hệ số nhân protocorm, chiều cao cây, số lá, số rễ.

Các số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm IRRISTAT 5.0 và Excel 2003. 

Địa điểm nghiên cứu: Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội, Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội và Học viện Hậu Cần, Ngọc Thụy, Gia Lâm, Hà Nội.

3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN


3.1. Khử trùng cơ quan nuôi cấy tạo nguồn vật liệu in vitro

3.1.1. Khử trùng chồi mầm lan

Kết quả ở bảng 1 cho thấy, mặc dù các công thức khử trùng được bố trí theo cấp độ tăng dần tác động của hóa chất vào mẫu cấy nhưng hiệu quả thu được sau 6 tuần theo dõi không tỷ lệ thuận. Ở CT3 cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất cũng chỉ đạt 8,89%. Nguồn mẫu sạch thu được từ chồi lan rất hạn chế, do tỷ lệ nhiễm cũng như tỷ lệ mẫu chết cao, có thể do nhiều nguyên nhân khách quan khác nhau. Chính vì vậy, chúng tôi phải sử dụng nguồn mẫu quả lan, để đưa vào nuôi cấy in vitro.

3.1.2. Khử trùng quả lan

Cả 3 công thức đều cho kết quả tối ưu trên nền môi trường MS (+ 100ml ND + 10g saccharose + 6g agar)/lít. Tuy nhiên, xét hiệu quả các công đoạn thao tác thì CT1 là tốt nhất. Sau 6 tuần nuôi cấy, có 97% hạt phát sinh protocorm và 3% nẩy cụm chồi (Bảng 2).

3.2. Nhân nhanh protocorm và cụm chồi theo phương pháp in vitro

3.2.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh protocorm và cụm chồi

Kết quả nhân nhanh protocorm (Bảng 3) cho thấy, sau 8 tuần nuôi cấy, các công thức thí nghiệm đều có sự khác nhau về giá trị của các chỉ tiêu nghiên cứu. Trong đó, trên nền môi trường KC, các chỉ tiêu theo dõi như đường kính cụm protocorm (2,26 cm), số lượng protocorm/cụm (210,06) và hệ số nhân - HSN (4,2 lần/8 tuần) có giá trị cao hơn các công thức môi trường khác ở độ tin cậy 95%. Mặt khác, xét hiệu quả kinh tế, KC là môi trường rẻ tiền và thông dụng trong nuôi cấy lan, vì vậy môi trường KC + (100ml nước dừa (ND)+10g saccaroza+6g agar)/lít được lựa chọn trong nuôi cấy nhân nhanh protocorm loài lan D. nobile.

Bảng 1. Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến khả năng sống của chồi mầm


 Bảng 2. Ảnh hưởng phương pháp khử trùng đến tỷ lệ mẫu sống và nẩy mầm của hạt lan 


 Bảng 3. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh (sau cấy 8 tuần)

Số chồi trung bình (TB)/cụm) và HSN chồi là khác nhau ở các CT môi trường khác nhau. Nền môi trường MS là tốt nhất cho HSN chồi (đạt 3,08 lần/8 tuần) và RE là thấp nhất (2,69 lần/8 tuần) (Bảng 4). Đối với lan Vanda dearei và Cymbidium findlaysonianum sự sinh trưởng của PLB tốt nhất là trên môi trường ½ MS sau đó đến môi trường KC và VW (Tawaro et al., 2008). Như vậy, môi trường MS + (100ml ND + 10g saccharose + 6g agar)/lít phù hợp nhất trong quá trình nhân nhanh cụm chồi D. nobile.

3.2.2. Ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy sử dụng nút bông đến khả năng nhân nhanh protocorm

Kết quả ở bảng 5 cho thấy, cùng sử dụng nút bông trong nuôi cấy nhưng ở môi trường lỏng lắc cho kết quả nhân nhanh protocorm tốt nhất, làm tăng hiệu quả trong nhân nhanh protocorm: số lượng protocorm/cụm là 105, khối lượng protocorm 45mg và HSN 2,10 lần/3tuần nuôi cấy. Mặt khác, nuôi cấy trong môi trường lỏng lắc sẽ tiết kiệm được môi trường do lượng môi trường sử dụng ít, không sử dụng agar, tiết kiệm điện năng so với nuôi cấy trong môi trường đặc.

3.2.3. Ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy sử dụng nút màng thoáng khí đến khả năng nhân nhanh protocorm

Kết quả cho thấy, việc sử dụng nút màng thoáng khí trong nuôi cấy mô đã làm tăng HSN và tăng khối lượng protocorm. Đặc biệt trong nuôi cấy thoáng khí lỏng lắc (CT3) đã nâng cao HSN vượt bậc (số lượng protocorm/cụm là 142, khối lượng protocorm 45,7mg, HSN 2,84 lần/3 tuần) (Bảng 6). Kết quả này đồng thời cho thấy, HSN protocorm của công thức nuôi cấy lỏng lắc màng lọc thoáng khí cao hơn và có hiệu quả hơn so với công thức lỏng lắc nút bông.

Bảng 4. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh cụm chồi 

Bảng 5. Ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy nút bông đến khả năng nhân nhanh protocorm (sau 3 tuần nuôi cấy)


Bảng 6. Ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy thoáng khí đến khả năng nhân nhanh protocorm (sau 3 tuần nuôi cấy)
3.2.4. Ảnh hưởng của hàm lượng saccharose đến quá trình nhân nhanh protocorm trong nuôi cấy đặc thoáng khí

Sau 8 tuần nuôi cấy trong nền môi trường đặc và sử dụng nút màng thoáng khí (Cellulose Acetate), ở CT4 (bổ sung 7,5g saccaroza/lít) cho các chỉ tiêu nhân nhanh protocorm vượt trội so với đối chứng và các công thức thí nghiệm khác (318,3 protocorm/cụm, HSN đạt 6,37 lần/8 tuần nuôi cấy) (Bảng 7 và Hình 2). Như vậy, nuôi cấy trong môi trường đặc thoáng khí đã cải thiện HSN protocorm từ 4,47 lần khi sử dụng nút bông trong nuôi cấy kinh điển lên 6,37 lần khi thay thế nút bông bằng nút màng lọc thoáng khí, đồng thời nâng cao hiệu quả nhân giống do đã giảm 25% hàm lượng saccharose.

Bảng 7. Ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose đến khả năng nhân nhanh protocorm trong nuôi cấy đặc thoáng khí (sau 8 tuần nuôi cấy)



Hình 2. Nuôi cấy thoáng khí trong môi trường đặc lan D. nobile

3.2.5. Ảnh hưởng của hàm lượng saccharose đến quá trình nhân nhanh protocorm trong
nuôi cấy lỏng lắc thoáng khí

Kết quả sau 4 tuần nuôi cấy trong nền môi trường lỏng lắc và sử dụng nút màng thoáng khí CA, các công thức bổ sung saccharose đều có hiệu quả trong nuôi cấy mô làm tăng HSN và tăng khối lượng protocorm (Bảng 8). Đặc biệt, nuôi cấy thoáng khí trong môi trường lỏng lắc đã nâng cao HSN vượt bậc, tăng hiệu quả, giảm giá thành do giảm chi phí môi trường nuôi cấy, giảm hàm lượng saccharose và giảm thời gian nuôi cấy. Công thức tối ưu (CT4) cho nhân nhanh protocorm là bổ sung 7,5g saccharose (ở mức tin cậy 95% HSN protocorm đạt 4,09 lần/4 tuần) (Bảng 8).

Bảng 8. Ảnh hưởng của hàm lượng saccharose đến khả năng nhân nhanh protocorm trong nuôi cấy lỏng lắc thoáng khí (Sau 4 tuần nuôi cấy)


3.2.6. Ảnh hưởng của các phương thức nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh cụm chồi

Kết quả ở bảng 9 cho thấy, có sự sai khác rõ rệt về các chỉ tiêu số lượng chồi TB/cụm, HSN chồi/4 tuần giữa các CT thí nghiệm. CT4 sử dụng hệ thống bioreactor cho nhân nhanh cụm chồi, số lượng chồi TB/cụm cao nhất đạt 51 chồi trong khi CT3, CT1 và CT2 chỉ đạt lần lượt là: 34, 28 và 18 chồi (Bảng 9). Căn cứ vào độ tin cậy 95% đánh giá đến chỉ tiêu HSN chồi/4 tuần thì CT4 là công thức tốt nhất so với CT1, CT2 (3,4 lần/4 tuần/CT4; 2,26 lần/4 tuần/CT3 và 1,86 lần/4 tuần/CT1; 1,20 lần/4 tuần/CT2). Như vậy, đối với loài D. nobile để nhân nhanh cụm chồi nên lựa chọn nuôi cấy bioreactor (nếu có sẵn thiết bị) hoặc nuôi cấy lỏng lắc thoáng khí trong môi trường MS + (100ml ND + 60g chuối chín + 30g saccharose)/lít.

3.3. Tạo cây hoàn chỉnh

3.3.1. Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng của chồi

Với mục đích tạo cây con có sức sống cao đạt tiêu chuẩn ra cây cần lựa chọn môi trường thích hợp nhất cho sinh trưởng của chồi lan. Các chồi thu được từ các thí nghiệm trên được tách riêng và cấy trên các môi trường khác nhau, 4 công thức/môi trường, 3 bình/công thức, 3 chồi/bình, chồi có chiều cao 3cm + 3 lá. Qua bảng 10, ở mức tin cậy 95%, CT4 - sử dụng nền môi trường RE - đạt các chỉ tiêu liên quan đến sinh trưởng chồi (chiều cao cây, số lá, số rễ) cao nhất, hơn hẳn các công thức thí nghiệm khác (chiều cao cây 4,88 cm/cây; 4,44 lá/cây; 3,69 rễ/cây). Như vậy, nền môi trường phù hợp nhất cho sinh trưởng chồi của D. nobile là RE.

Bảng 9. Ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh cụm chồi
(sau 4 tuần nuôi cấy)


Bảng 10. Ảnh hưởng của loại môi trường đến sinh trưởng chồi (sau 6 tuần nuôi cấy)

3.3.2. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng tới sinh trưởng của chồi

Ánh sáng trong nuôi cấy mô thực vật là ánh sáng nhân tạo, cường độ ánh sáng 1000~5000 lux, 16h chiếu sáng. Để chồi loài lan rừng in vitro phát triển hoàn chỉnh thì cần điều chỉnh cường độ ánh sáng thích hợp. Trong 4 công thức với những dải cường độ ánh sáng khác nhau trong cùng chu kỳ chiếu sáng. Ở CT4, chồi D. nobile được nuôi cấy ở cường độ chiếu sáng 2300 lux đã giúp cây phát triển mạnh nhất (lá mở to, mầu xanh sẫm, bóng; thân mập; bộ rễ phát triển mạnh) (Bảng 11, Hình 3).

Bảng 11. Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến sinh trưởng chồi 




Hình 3. Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến sinh trưởng của chồi lan D. nobile

3.3.3. Ảnh hưởng của than hoạt tính (THT) đến khả năng sinh rễ của chồi

Sau 30 ngày nuôi cấy, ở CT2 (bổ sung 0,5g THT/lít môi trường), chồi mập, rễ nhiều nhất (3,46/cây) và số rễ nhiều hơn hẳn các công thức khác ở mức tin cậy 95% (Bảng 12). Tuy nhiên, khi bổ sung tăng dần lượng THT thì chiều cao cây lại theo xu thế giảm dần, điều này có thể do THT ở nồng độ cao đã hấp phụ một số chất điều tiết sinh trưởng tự nhiên và dinh dưỡng nên làm giảm tốc độ sinh trưởng của cây. Vậy, môi trường tối ưu tạo cây hoàn chỉnh cho lan D.nobile là: RE + (10g saccharose+0,5g THT+6g agar)/lít, cường độ ánh sáng 2300lux.

Bảng 12. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng tạo rễ của chồi (sau 30 ngày nuôi cấy) 

4. KẾT LUẬN


Nguồn vật liệu ban đầu là quả lan. Khử trùng tối ưu là nhúng quả trong cồn 96% rồi đốt trên ngọn lửa đèn cồn. Môi trường gieo hạt thích hợp là: MS + (100ml nước dừa + 10g saccharose+6g agar)/lít môi trường. Nhân nhanh in vitro bằng nuôi cấy mô kinh điển: Môi trường nhân nhanh protocorm tối ưu là KC + (100ml nước dừa + 10g saccaroza + 6g agar)/lít; HSN 4,2 lần/8 tuần nuôi cấy. Môi trường nhân nhanh cụm chồi tốt nhất là MS + (100ml ND+10g saccharose+6g agar)/lít, HSN chồi 3,08 lần/8 tuần nuôi cấy.

Nhân nhanh in vitro nhờ nuôi cấy mô cải tiến: kỹ thuật nuôi cấy lỏng lắc nút bông và nuôi cấy lỏng lắc thoáng khí đã tăng HSN protocorm đạt 1,9 và 2,3 lần so với đối chứng. Nuôi cấy đặc, màng lọc thoáng khí làm giảm 25% lượng saccharose bổ sung vào môi trường nuôi cấy và tăng HSN protocorm lên gấp 1,4 lần so với nuôi cấy kinh điển. Nhân nhanh cụm chồi bằng kỹ thuật bioreactor giảm thời gian nhân giống và cải thiện chất lượng chồi.

Môi trường tối ưu tạo cây hoàn chỉnh là RE +(10g saccharose+0,5g than hoạt tính)/lít, cường
độ ánh sáng 2.300lux.


TÀI LIỆU THAM KHẢO


Nguyễn Tiến Bân và nhiều tác giả (2007). Sách Đỏ Việt Nam, Phần Thực vật; NXB. Khoa học Tự
nhiên và Công nghệ, Hà Nội.

Lê Văn Hoàng (2008). Giáo trình nuôi cấy mô tế bào thực vật. Đại học Đà Nẵng

Trần Văn Huân, Văn Tích Lượm (2007). Kỹ thuật nuôi trồng cây lan. NXB thành phố Hồ Chí Minh.
Dương Đức Huyến (2007). Thực vật chí Việt Nam, 9-
Họ lan (Orchidceae). NXBKH Kỹ thuật

Nguyễn Văn Song 2011). Nhân nhanh in vitro lan Kim Điệp (Dendrobium chrysotoxum)-một loài lan rừng có nguy cơ tuyệt chủng. Tạp chí khoa học ĐH Huế 64:127-136.

Đào Thị Thanh Vân, Đặng Thị Tố Nga (2008). Giáo trình hoa lan. NXB Nông nghiệp, Hà Nội. Kauth P. (2005). In vitro seed germination and seedling development of Calopogon tuberosus and Sacoila
lanceolata var. lanceolata: Two Florida native terrestrial orchids. Master thesis, University of Florida

Kusumoto and Furukawa (1977). Effect of Organic Matter on the Growth of Cymbidium Protocorms
Cultured in vitro, Japan. Soc. Hort. Sci. 45 (4): 421-426.

Shu Fung Lo, Satish Manohar Nalawade, Chao Lin Kuo, Chung Li Cheng and Hsin Sheng Tsay
(2004). Asymbiotic germination of immature seeds, plantlet development and ex vitro establishment of plants of Dendrobium tosaense makino-a medicinally important orchild, In vitro Cellular and Developmental Biology - Plant 40 (5): 528-535.

Tawaro Supavadee, Suraninpong Potjamarn and Chanprame Sontichai (2008). Germination and
Regeneration of Cymbidium findlaysonianum Lindl.on a Medium Supplemented with Some Organic Sources. Walailak J Sci & Tech 5 (2): 125-135.

Nguồn: Vũ Ngọc Lan*, Nguyễn Thị Lý Anh(2013).NHÂN GIỐNG IN VITRO LOÀI LAN BẢN ĐỊA DENDROBIUM NOBILE LINDL.Tạp chí Khoa học và Phát triển 2013, tập 11