SMiA là một giống dâu tây cảnh với những đặc điểm nổi trội như trái hình tim, chín đỏ mọng với mùi hương đặc biệt là sự hòa quyện giữa dâu tây, hoa hồng, dứa và vị ngọt của mật ong. Nghiên cứu được tiến hành nhằm xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây dâu tây SmiA từ vật liệu ban đầu là chồi nảy mầm từ hạt. Hệ số nhân chồi đạt cao nhất (7,8 chồi/mẫu) sau 5 tuần nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 0,4 mg/l BA. Môi trường thích hợp để tạo rễ cho chồi in vitro là môi trường bán lỏng MS bổ sung 0,25 mg/ α-NAA, tỷ lệ chồi tạo rễ đạt 93,33%, số rễ trung bình đạt 12,36 rễ/chồi, chiều dài rễ trung bình đạt 1,49 cm sau 4 tuần nuôi cấy. Trên giá thể đất phù sa, tỷ lệ cây sống cao, sinh trưởng tốt.Chế độ bón phân NPK kết hợp Atonik thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của cây dâu tây SmiA in vitro với chiều cao cây trung bình đạt 19,13 cm sau 1 tháng chăm sóc. Hoa nở sau 20 - 25 ngày hình thành nụ và quả chín sau 30 - 35 ngày.
Từ khóa: Dâu tây, nhân nhanh, ra rễ, thích ứng cây ngoài tự nhiên
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Dâu tây Alpine (Fragariavesca) là một loài thực vật có hoa, kích thước nhỏ, thuộc họ Hoa hồng (Rosaceae). Loại dâu tây này cho quả có kích thước nhỏ hơn nhiều so với các loại dâu tây trồng ăn quả hiện nay như dâu tây giống Nhật, dâu tây giống Mỹ, dâu tây giống Pháp và dâu tây giống New Zealand. Tuy nhiên, dâu tây Alpine hấp dẫn bởi dễ trồng, cây sinh trưởng tốt, có thể ra hoa và tạo quả quanh năm, hình dáng quả đẹp, màu sắc đa dạng, vị ngọt và đặc biệt có hương thơm quyến rũ.
Dâu tây SMiA (Alpine Strawberries Mignonette) là một giống thuộc nhóm dâu tây Alpine với những đặc điểm nổi trội như cây nhỏ xinh, bông chùm, trái đỏ mọng hình tim đẹp mắt và được nhập nội từ Mỹ. Theo Renee's Garden mô tả, hương vị dâu tây SMiA là sự kết hợp thần kì giữa tinh hoa của dâu tây, hoa hồng, dứa và cả mật ong (https://www.reneesgarden.com/products/strawberry-alpine-mignonette).
Với những ưu điểm như trên, giống dâu SmiA là lựa chọn hàng đầu đáp ứng nhu cầu chơi hoa cây cảnh trang trí ngày càng cao của thị trường. Mặt khác, trong các nghiên cứu về chuyển gen, đột biến, việc thiết lập một hệ thống tái sinh chồi hiệu quả là yêu cầu tiên quyết (Haymes & Davis,1998; Zakaria et al., 2014). Các giống dâu tây trồng hiện nay có hạn chế rất lớn trong việc xây dựng quy trình tái sinh chồi cũng như chuyển gen do độ bội thể tương đối lớn. Trong khi đó, dâu tây Alpine là loài lưỡng bội có độ bội thấp 2n = 2x =14, có bộ genome kích thước nhỏ (khoảng 250 Mb), lại có chu kỳ sinh sống tương đối ngắn. Do đó, loại dâu tây này được xem là một cây mô hình hiệu quả trong nghiên cứu genome, di truyền phân tử của họ Hoa hồng (Oosumi et al., 2006; Slovin et al., 2009), đồng thời cũng là một mục tiêu để nghiên cứu tạo đột biến, chuyển gen cũng như phát triển các chương trình lai chọn tạo giống (Mansouri et al.,1996; Haymes et al.,1997). Tuy nhiên, SmiA là giống dâu tây nhập nội nên giá thành hạt giống SmiA cao, hạt giống có kích thước rất nhỏ, tỷ lệ nảy mầm thấp và thời gian nảy mầm rất chậm. Đây là những hạn chế rất lớn trong quá trình phát triển giống dâu này phục vụ cho mục đích nghiên cứu cũng như cung cấp cho thị trường. Để khắc phục những hạn chế đó, phương pháp nhân giống in vitro được xem là biện pháp kỹ thuật phù hợp cho phép nhân nhanh tạo ra số lượng cây lớn, đồng nhất về mặt di truyền, sạch bệnh đáp ứng được nhu cầu về số lượng cây giống chất lượng cao, ổn định cho sản xuất. Từ những lý do trên, nghiên cứu này được tiến hành với mục tiêu tìm ra các thông số kỹ thuật thích hợp cho quy trình nhân giống in vitro cây dâu tây SMiA làm cơ sở cho việc nhân nhanh các nguồn gen ưu tú phục vụ cho công tác chọn tạo giống mới bằng kỹ thuật lai tạo và chuyển gen.
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
Hạt giống dâu tây SMiA (Alpine StrawberriesMignonette) được cung cấp bởi công ty Renee'sGarden, Mỹ.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Khử trùng mẫu hạt
Hạt giống dâu tây được rửa bằng nước xà phòng loãng và rửa lại dưới vòi nước chảy. Tiếp theo, hạt được khử trùng bằng cồn 70% trong 30 giây, khử trùng tiếp bằng Ca(HClO)2 0,5 % trong 30 phút, rồi rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3 - 4 lần, mỗi lần 1 phút.
Thấm khô hạt bằng giấy thấm vô trùng trước khi cấy hạt vào môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) bổ sung 0,5 mg/l BA để kích thích sự nảy mầm của hạt.
2.2.2. Tái sinh chồi
Chồi dâu tây thu được sau khi nảy mầm đượccắt ra và tái sinh trên môi trường MS bổ sung 2 mg/l BA sau 4 tuần. Các chồi sau tái sinh này sẽ được sử dụng để bố trí các thí nghiệm nhân nhanh.
2.2.3. Nhân nhanh
Chồi tái sinh có chiều cao 2 - 2,5 cm, lá xanh bóng, sinh trưởng khỏe mạnh được đặt trên các môi
trường nuôi cấy có bổ sung các chất điều tiết BA, αNAA riêng rẽ và phối hợp ở các nồng độ khác nhau.
2.2.4. Tạo rễ cho chồi in vitro
Các chồi có chiều cao 3 - 3,5 cm, sinh trưởng và phát triển tốt được cấy chuyển sang môi trường MS bổ sung 0,25 mg/l α-NAAvới các kiểu nuôi cấy (lỏng, đặc, bán lỏng) để kích thích tạo rễ. Trong đó môi trường đặc là môi trường có bổ sung 7,0 g/l agar; môi trường lỏng, không bổ sung agar và môi trường
bán lỏng là môi trường bổ sung 3,5 g/l agar. Môi trường nuôi cấy in vitro MS cơ bản + 30 g/l sucrose + 7,0 g/l agar được điều chỉnh pH = 5,8 trước khi hấp khử trùng ở áp suất 1,1 atm, nhiệt độ 121oC trong 20 phút. Điều kiện nuôi cấy in vitro: 16 h sáng/8 h tối, cường độ ánh sáng 2.000 - 2.500 lux, nhiệt độ 25 ± 2oC.
2.2.5. Thích nghi cây ngoài vườn ươm
Cây in vitro hoàn chỉnh, chiều cao 3 - 4 cm, có 4 - 5 lá, bộ rễ tốt được chuyển ra vườn ươm (để nguyên trong bình) để tập nắng trong 2 - 3 ngày. Sau đó, cây được lấy ra khỏi bình, rửa sạch môi trường bám trên rễ và cấy vào vỉ xốp có chứa các loại giá thể khác nhau bao gồm đất (100%); đất: trấu hun (1:1); đất: xơ dừa (1:1); đất: trấu hun: xơ dừa (1:1:1); xơ dừa (100%). Thí nghiệm ra cây in vitro được tiến hành vào vụ hè thu (đầu tháng 9), cây được che 60% nắng trực tiếp bằng lưới đen thoáng từ 9 h -17 h.
Tưới nước giữ ẩm 3 lần/ngày trong tháng đầu tiên và 2 lần/ngày từ tháng thứ 2. Đồng thời bước đầu đánh giá được ảnh hưởng của một số loại phân bón đến khả năng sinh trưởng, phát triển của cây dâu tây in vitro trong điều kiện nhà lưới.
2.2.6. Bón phân
Dựa trên khuyến cáo sử dụng và các phương pháp bón phân phổ biến cho dâu tây, chúng tôi đã sử dụng chế độ bón phân như sau: NPK: trộn cùng giá thể khi trồng cây, cách 1 tuần bổ sung quanh gốc cây 1 lần; Atonik: pha với nước, phun qua lá 1 tuần phun 1 lần, bắt đầu từ thời điểm bắt đầu trồng cây đến khi cây đậu quả; Phân bón lá “Đầu Trâu”: pha với nước, phun qua lá 1 tuần 1 lần. Loại 501: bắt đầu từ thời điểm trồng cây đến khi cây ra hoa; Loại 507: từ khi cây ra hoa đến khi cây đậu quả.
2.2.7. Bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu
Các thí nghiệm trong phòng thí nghiệm được bố trí nhắc lại 3 lần mỗi công thức, mỗi lần 10 mẫu. Các chỉ tiêu theo dõi được quan sát và đo đếm sau 5 tuần đối với các thí nghiệm nhân nhanh và 4 tuần với các thí nghiệm ra rễ. Các thí nghiệm ngoài vườn ươm được bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 30 mẫu, theo dõi cho đến khi đậu quả. Số liệu được xử lý thống kê theo chương trình Excel và IRRISTART 4,0.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nhân nhanh chồi dâu tây SmiA
3.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi dâu tây
Trong môi trường in vitro, hàm lượng cytokinin cao sẽ làm giảm số lượng chồi/cụm chồi cũng như chất lượng chồi, trong nhiều trường hợp dẫn đến hiện tượng thủy tinh hóa của cụm chồi (Wang et al., 1984). Theo Kang et al. (1994), BA là chất điều hòa sinh trưởng thực vật thích hợp nhất trong việc nhân chồi từ mô lá của dâu tây Fragaria × ananassa. Kết quả tương tự cũng được báo cáo bởi Bhatt & Dhar (2000), BA có hiệu quả tốt nhất trong việc kích thích phát sinh chồi in vitro đối với dâu tây so với 2-ip và kinetin. Trong thí nghiệm này, dải nồng độ thấp của BA từ 0,1 mg/l đến 0,6 mg/l được bổ sung vào môi trường nuôi cấy MS để theo dõi khả năngnhân nhanh cũng nhưsinh trưởng của chồi dâu tây SmiA. Kết quả sau 5 tuần theo dõi được trình bày ở bảng 1.
Kết quả ở thu được ở bảng 1 cho thấy BA có ảnh hưởng tốt đến hiệu quả nhân chồi trên giống dâu tây SMiA. Tất cả các công thức có bổ sung BA thì hệ số nhân chồi đều cao hơn so với công thức đối chứng 2 - 3 lần. Hệ số này tăng lên khi tăng nồng độ BA từ 0 - 0,4 mg/l, tuy nhiên chững lại và giảm nhẹ khi nồng độ BA tăng lên đến 0,5 - 0,6 mg/l. Công thức môi trường có bổ sung 0,4 mg/l BA cho hệ số nhân cao nhất (7,8 chồi/mẫu), chồi có chiều cao đồng đều, cây chắc khỏe. Bên cạnh đó, chiều cao chồi có xu hướng giảm khi nồng độ BA tăng (Bảng 1). Ảnh hưởng nồng độ thấp BA đến khả năng nhân nhanh của cây dâu tây đã được công bố trong nhiều báo cáo (Marcotrigiano et al., 1984; Mahmood et al., 1994; Ashirafuzzaman et al., 2013). Các kết quả nghiên cứu này đã chỉ ra rằng nồng độ thấp của BA (0,5 mg/l) mang lại hiệu quả nhân chồi dâu tây tốt hơn so với nồng độ BA cao ở mức 2 - 3 mg/l khi sử dụng đoạn thân chứa mắt. Kết quả nghiên cứu của Phạm Xuân Tùng và Phạm Thị Lan (2009) trên chồi đỉnh giống dâu tây Angelique (Mỹ đá) cho thấy nồng độ BA 0,4 - 0,6 mg/l kích thích tốt sự tạo chồi. Trong công bố gần đây, Nguyễn Trần Đông Phương và Bùi Thị Thu Hằng (2017) cũng đã chỉ ra nồng độ 0,6 mg/l BA thích hợp cho sự tạo chồi có nguồn gốc từ hạt dây tây New Zealand. Kết quả của các tác giả đưa ra đều có mức nồng độ BA tương đồng hoặc cao hơn một chút với kết quả nghiên cứu hiện tại (0,4 mg/l BA). Mặt khác, Sakila et al. (2007) và Ara et al. (2013) lại chỉ ra rằng hệ số nhân chồi dâu tây cao nhất đạt được trên môi trường MS bổ sung 1,5 mg/l BA khi sử dụng thân bò có chứa mắt làm vật liệu nuôi cấy. Sự khác biệt này có thể là do phản ứng giống (genotype) và điều kiện sinh lý khác nhau của mẫu cấy. Việc tìm ra công thức với nồng độ BA thấp (0,4 mg/l) mà vẫn cho hệ số nhân chồi cao đã giúp giảm đáng kể chi phí trong bước nhân nhanh cây dâu tây in vitro. Do vậy, 0,4 mg/l được lựa chọn là nồng độ BA tốt nhất để nhân chồi dâu tây và được sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng nhân nhanh chồi dâu tây
Hầu hết ở cơ thể sinh vật, các chất điều hòa sinh trưởng thường tương tác với nhau để tạo ra những ảnh hưởng cuối cùng trong mọi quá trình sinh trưởng, phát triển (Gaspar et al., 1996). Sự kết hợp giữa BA và α-NAA thúc đẩy cảm ứng tạo chồi và nhân chồi đã được công bố ở nhiều loại cây như hoa hồng (Carelli et al., 2002; Pati et al., 2006); một số cây thảo dược như Rauvolfia tetraphylla (Faisal & Anis 2002); Psoralea corylifolia (Anis & Faisal 2005); Asteracantha longifolia (Panigrahi et al., 2007). Theo nghiên cứu của Bhatt & Dhar (2000) và Hasan et al. (2010) môi trường nhân nhanh chồi dâu tây tốt nhất đạt được trên môi trường có bổ sung BA kết hợp α-NAA. Trên cơ sở đó, nồng độ 0,4 mg/l BA tốt nhất thu được ở nghiên cứu trước được kết hợp với α-NAA ở nồng độ thấp từ 0 - 0,5 mg/l. Việc bổ sung α-NAA vào các công thức thí nghiệm làm giảm hệ số nhân chồi, chiều cao chồi cũng như chất lượng chồi một cách rõ rệt. Về cơ bản, các thông số đã giảm theo chiều tăng của nồng độ α-NAA từ 0 - 0,5 mg/l. Cụ thể, hệ số nhân giảm dần từ 3,03 chồi/mẫu công thức bổ sung 0,4mg/l BA và 0,1 mg/l α-NAA xuống còn 1,94 chồi/mẫu ở công thức 0,4mg/l BA và 0,5 mg/l α-NAA, các chồi hình thành có xu hướng hình thành cụm nhỏ, không phát triển về chiều cao và đặc biệt có sự hình thành callus ở gốc (Hình 3).
Như vậy, kết quả nghiên cứu cho thấy rằng việc kết hợp BA và α-NAA không đem lại hiệu quả trong nhân nhanh chồi dâu tây SmiA. Kết quả này trái với những nhận định của Uppadhaya & Chandra (1983) rằng BA kết hợp với auxin thúc đẩy sự hình thành chồi ở nhiều loại cây. Sự khác biệt này có thể do nhiều nguyên nhân như phản ứng đặc thù của giống hoặc sự hình thành callus là một trong các nguyên nhân ức chế sự nhân chồi ở giống dâu tây SmiA. Theo kết quả nghiên cứu của Biswas et al. (2007), tỷ lệ hình thành mô sẹo tỷ lệ thuận với việc tăng nồng độ α-NAA trong môi trường nuôi cấy. Ara et al. (2012) cũng thu được kết quả tương tự, phản ứng tạo mô sẹo tốt nhất đạt được trên môi trường bổ sung 2 mg/l BA và 0,5 mg/l α-NAA khi quá trình nhân chồi.
3.2. Tạo cây hoàn chỉnh
3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng ra rễ của chồi dâu tây
Sự phát triển khỏe mạnh của hệ rễ cây con trong nuôi cấy in vitro là điều kiện thiết yếu cho sự phát triển tốt của cây con trong điều kiện nhà
